Nota de aplicación | TURBIDI.T™
¿Cómo Medir la Concentración Celular Mediante Turbidez?
por Gloria Pinilla y Nora Kasaplar,
Aplicación Científicos, Rheolution Inc.
En colaboración con
Escuela Nacional Superior de Tecnología de Biomoléculas de Burdeos (ENSTBB).
Resumen
- La creciente demanda de métodos más rápidos para cuantificar células va más allá de las cámaras de recuento tradicionales, lo que da lugar a soluciones innovadoras que facilitan un recuento preciso y reducen el tiempo necesario.
- La turbidez, que refleja la opacidad de la solución debido a la presencia de partículas que dispersan la luz, resulta ser un método eficaz para acelerar la cuantificación celular.
- En esta nota de aplicación, se ha establecido una fuerte correlación entre la turbidez (FTU) de una solución de cultivo de S. cerevisiae y el número de células (células/ml) contadas con una cámara de recuento celular convencional.
- Usar TURBIDI.T™ para hacer mediciones precisas de la turbidez te ofrece una forma rápida y fácil de calcular el número de células, lo que te ahorra tiempo y recursos en el recuento rutinario de células.
EXPLORACIÓN DE ALTERNATIVAS PARA EL RECUENTO DE CÉLULAS MEDIANTE LA MEDICIÓN DE LA TURBIDEZ
Introducción
En el ámbito del análisis de cultivos celulares, la necesidad de contar con métodos eficaces para cuantificar las células ha llevado a buscar alternativas a la técnica tradicional de las cámaras de recuento celular, que lleva mucho tiempo. Este método convencional, aunque es fiable, plantea dificultades en cuanto a rapidez y practicidad, sobre todo ante las crecientes exigencias de la investigación y la industria.
La turbidez, que mide el grado de opacidad de una solución, se perfila como un enfoque interesante para acelerar la cuantificación celular. Se ha observado que el nivel de turbidez en un medio está relacionado con la concentración celular en un cultivo celular [1]. Aprovechando esta relación, esta nota de aplicación presenta un nuevo método para determinar rápidamente el número de células. Este método aprovecha las capacidades de TURBIDI.T™, un instrumento compatible con el IoT diseñado para medir la turbidez con precisión. Con esta herramienta, te ofrecemos una técnica práctica y eficaz para estimar el número de células a partir de mediciones de turbidez, lo que supone un gran avance en las metodologías de cuantificación celular.
Figura 1: Relación entre la turbidez y la concentración celular. Las concentraciones celulares bajas hacen que pase mucha luz a través de la muestra, lo que se detecta como una turbidez baja (izquierda), mientras que una concentración celular alta hace que pase menos luz, lo que se detecta como valores altos de turbidez en la muestra. Las flechas azules indican la dirección de la luz.
METODOLOGÍA PARA EL RECUENTO DE CÉLULAS MEDIANTE TÉCNICAS DE TURBIDEZ Y TINTE
Materiales y métodos
Las células de Saccharomyces cerevisiae (5-10 µm) se cultivaron en un biorreactor (BIOSTAT B; Sartorius Stedim Biotech, Göttingen, Alemania) tal y como se explica en nuestra nota de aplicación anterior (Figura 2).
Figura 2: Configuración del biorreactor para el cultivo de levadura en condiciones estériles.
Se inoculó levadura en el biorreactor a partir de un precultivo de levadura que se había dejado crecer durante toda la noche. Se inoculó un volumen de 100 ml para conseguir un valor inicial de turbidez de 200 FTU. Tras la inoculación, se tomaron alícuotas estériles cada dos horas y se determinó el número de células (es decir, la concentración celular) mediante el método de tinción con azul de metileno. Este método se basa en un colorante, el azul de metileno, que se adhiere a los componentes celulares y los tiñe de azul. Este colorante reacciona de forma diferente en las células viables y en las no viables, ya que las células vivas lo transforman (por lo que permanece incoloro), mientras que las células muertas siguen teñidas de azul. Las células teñidas se colocaron en un hemocitómetro (también conocido como cámara de recuento celular o cámara de Malassez) y se observaron bajo el microscopio (x40). El hemocitómetro tiene nueve cuadrados de 1 x 1 mm (1 mm²). Para cada medición se utilizó un volumen de 1 µL.
La turbidez de las soluciones se determinó con el TURBIDI.T™. El instrumento se calibró con patrones de formazina (1-4000 FTU). La emisión y recepción de luz se realizaron utilizando cartuchos Emitt.805 (850 nm) y cartuchos Receiv.ViS (longitud de onda entre 400 nm y 1000 nm), respectivamente. Se utilizó una longitud de onda de 850 nm, ya que la absorción de luz por parte de la muestra era menor (datos no mostrados). En este trabajo, decidimos usar viales de 10 ml, en los que se dividieron las muestras en alícuotas y se midieron con el TURBIDI.T™. Los datos se recopilaron y se mostraron en la tableta en la que se ejecutaba la aplicación Soft Matter Analytics App™.
Tanto el recuento celular como las mediciones de turbidez se realizaron por triplicado (n = 3). Los datos se presentan como la media ± la desviación estándar. La variabilidad se define como la relación entre la desviación estándar y el valor medio.
ANÁLISIS COMPARATIVO Y CORRELACIÓN DE LOS PARÁMETROS DE TURBIDEZ Y RECUENTO CELULAR
Resultados y discusión
Se analizaron alícuotas celulares en la fase de crecimiento del cultivo de levadura midiendo la turbidez y contando las células con una cámara de recuento celular. La figura 3 muestra la evolución temporal de ambos parámetros, que aumentan con el tiempo. En el gráfico se aprecia que la evolución de la turbidez y la concentración celular siguen la misma tendencia, que en general es exponencial. El aumento de la concentración celular influye directamente en la turbidez del cultivo. Cuantas más células hay, más luz se dispersa y mayor es la turbidez general del medio.
Las mediciones de turbidez fueron más consistentes (con una variabilidad del 3,8 %) en comparación con la técnica de recuento celular (con una variabilidad del 17,6 %). Esta diferencia se puede atribuir a imprecisiones en el recuento debidas a la percepción humana, pero también a la diferencia en el volumen de muestra entre los dos métodos. Mientras que el recuento celular utiliza 1 µl de muestra, en este estudio la evaluación de la turbidez se realiza con alícuotas de 10 ml. Especialmente en situaciones con bioreactores de mayor volumen (como en nuestro caso, 2 L), un volumen de muestra considerable contribuye a una representación más completa de los procesos que tienen lugar en el cultivo celular, lo que, en consecuencia, ofrece una estimación más precisa.
Figura 3: Evolución a lo largo del tiempo en un cultivo de S. cerevisiae de (A) la turbidez (FTU) y (B) la concentración celular (células/mL), contadas con una cámara de recuento celular.
La figura 4 muestra la correlación lineal entre las mediciones de turbidez y el recuento celular mediante microscopía. La curva viene dada por la ecuación: y = 32 345x – 4 894 248 y tiene un coeficiente de determinación R² = 0,998.
Figura 4: Correlación entre el número de células contadas con una cámara de recuento celular y la turbidez obtenida con TURBIDI.T™
Es interesante observar que se pueden crear gráficos similares utilizando diferentes medios de cultivo y tipos de células microbianas para reflejar esta correlación. El gráfico obtenido se puede utilizar luego para estimar el recuento celular de una muestra, simplemente correlacionando el valor de turbidez medido con TURBIDI.T™ con el número de células correspondiente. Este método de inferencia consta de cuatro pasos sucesivos (Figura 5):
- Se reparten alícuotas de una muestra que contiene una concentración desconocida de células en uno o varios viales.
- Se coloca la probeta en la cámara del TURBIDI.T™ y se realiza una medición. Los resultados se muestran en la aplicación Soft Matter Analytics™.
- Al usar la curva de correlación (células/mL frente a FTU), las FTU se relacionan con la densidad celular.
- La concentración celular se calcula utilizando la ecuación de la curva.
Figura 5: Un método para estimar la concentración celular en un medio de cultivo líquido con turbidez.
Conclusiones y perspectivas
- La turbidez de las células de levadura en un medio de cultivo líquido se puede medir fácilmente con el sencillo instrumento TURBIDI.T™.
- En el TURBIDI.T™, puedes elegir entre diferentes longitudes de onda de emisión de luz para adaptarte mejor al tipo y tamaño de las partículas o células. En el caso de las soluciones coloreadas, se ha demostrado que 850 nm es la longitud de onda más precisa, ya que la absorbancia de la muestra no afecta a los resultados.
- El análisis del recuento celular con una cámara de recuento convencional presenta una fuerte correlación con los valores de turbidez (R² = 0,998), lo que demuestra que se puede desarrollar fácilmente y utilizar de forma eficaz un método de inferencia para estimar el número de células en un medio de cultivo.
- Las funciones de adquisición rápida de TURBIDI.T™, junto con la aplicación Soft Matter Analytics™, que es muy fácil de usar, te ayudan a cuantificar rápidamente las células mediante la turbidez y, en definitiva, a ahorrar tiempo y recursos en el laboratorio cuando hay que hacer recuentos celulares rutinarios.
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Referencias
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