Blog Post Image: Methods to Quantify Cell Concentration Using TURBIDI.T™ Technology.

应用说明 | TURBIDI.T™

如何利用浊度测量细胞浓度？

by Gloria Pinilla and Nora Kasaplar,

应用科学家们， Rheolution Inc.

与

波尔多国家生物分子技术高等学院（ENSTBB）。

摘要

随着对更快速细胞定量方法需求的日益增长，传统细胞计数板已难以满足需求，这促使人们开发出既能确保计数准确性又能缩短时间的创新解决方案。
浊度反映了溶液中存在光散射粒子时产生的浑浊现象，已成为加速细胞计数的一种有效方法。
在本应用说明中，证实了酿酒酵母（S. cerevisiae）培养液的浊度（FTU）与使用常规计数板测得的细胞数（细胞/mL）之间存在显著相关性。
利用TURBIDI.T™进行精确的浊度测量，提供了一种操作简便且快速的方法来估算细胞数量，从而在常规细胞计数中节省时间和资源。

通过浊度测量探索细胞计数的替代方法

引言

在细胞培养分析领域，对高效细胞定量方法的需求促使人们开始寻找替代方案，以取代耗时的传统计数板技术。这种传统方法虽然可靠，但在速度和实用性方面仍存在挑战，尤其是在研究和工业需求日益增长的背景下。

浊度作为衡量溶液混浊程度的指标，已成为一种加速细胞计数的有趣方法。培养基中的浊度水平与细胞培养中的细胞浓度存在关联[1]。基于这一关联，本应用说明介绍了一种快速测定细胞数量的新方法。该方法利用了TURBIDI.T™的功能——这是一款专为精确测量浊度而设计的、支持物联网（IoT）的仪器。通过运用该工具，我们提出了一种基于浊度测量的、实用且高效的细胞计数估算技术，这标志着细胞定量方法取得了重大进展。

图1： 浊度与细胞浓度之间的关系。低细胞浓度会导致样本的光透过率较高，检测结果表现为低浊度（左图）；而高细胞浓度会导致光透过率降低，检测结果表现为样本中的高浊度值。蓝色箭头指示光线传播的方向。

基于浊度和染色技术的细胞计数方法

材料与方法

按照我们先前应用说明中的说明（图2），将酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞（5-10 µm）在生物反应器（BIOSTAT B；Sartorius Stedim Biotech，德国哥廷根）中培养。

图2： 用于在无菌条件下培养酵母的生物反应器装置。

将从过夜培养的酵母预培养液中取样，接种到生物反应器中。接种体积为100 mL，以使初始浊度值达到200 FTU。接种后，每两小时取一份无菌样本，并通过亚甲蓝染色法测定细胞数量（即细胞浓度）。该方法基于一种名为亚甲蓝的染料，该染料会附着于细胞成分并将其染成蓝色。该染料在活细胞和非活细胞中的反应不同：活细胞会代谢该染料（使其保持无色），而死细胞则保持蓝色。将染色的细胞置于血细胞计数板（又称细胞计数板或马拉塞兹计数板）上，并在显微镜下（40倍放大）进行观察。血细胞计数板由九个1×1毫米（1平方毫米）的方格组成。每次测量均使用1微升的样本体积。

溶液的浊度是使用TURBIDI.T™测定的。该仪器使用福马津标准品（1-4000 FTU）进行了校准。发光和受光分别通过Emitt.805滤光片（850 nm）和Receiv.ViS滤光片（波长范围为400 nm至1000 nm）实现。由于样品对光的吸收影响较小（数据未显示），因此采用了850 nm的波长。在本研究中，我们选择使用10 mL小瓶，将样品分装其中，并在TURBIDI.T™上进行测量。数据是在运行“Soft Matter Analytics App™”的平板电脑上收集并显示的。

细胞计数和浊度测量均进行了三重复（n=3）。数据以平均值±标准差表示。变异度定义为标准差与平均值之比。

浊度和细胞计数指标的比较分析与相关性研究

结果与讨论

对酵母培养物生长阶段的细胞等分样本，通过测定浊度和使用计数板进行细胞计数进行了分析。图3显示了这两个参数随时间的变化趋势，两者均随时间推移而增加。从图中可以看出，浊度和细胞浓度的变化趋势一致，总体呈指数增长。细胞浓度的增加直接影响培养液的浊度。更多的细胞会散射光线，从而影响培养基的整体浊度。

与细胞计数法（变异率为17.6%）相比，浊度测定结果更为一致（变异率为3.8%）。这种差异既可归因于人为感知导致的计数不准确，也与两种方法的样本体积不同有关。细胞计数采用 1 µL 样本，而本研究中的浊度测定则使用 10 mL 的等分样本。特别是在涉及较大生物反应器容积（如本研究中的 2 L）的情况下，较大的样本体积有助于更全面地反映细胞培养中的进行中的过程，从而提供更准确的估计。

图3：酿酒酵母（S. cerevisiae）培养过程中（A）浊度（FTU）和（B）细胞浓度（细胞/mL）随时间的变化，细胞浓度采用计数板测定。

图4展示了浊度测量值与显微镜下细胞计数之间的线性相关性。该曲线由方程y=32 345x-4 894 248表示，其决定系数R²=0.998。

图4： ：使用TURBIDI.T™测得的浊度与通过计数室计数的细胞数之间的相关性

值得注意的是，使用不同的培养基和微生物细胞类型，均可绘制出类似的图表来反映这种相关性。随后，只需将使用TURBIDI.T™测得的浊度值与相应的细胞数量建立关联，即可利用所得图表估算样品中的细胞数量。该推理方法包括四个连续的步骤（图5）：

将含有未知浓度细胞的样品分装到（一个或多个）小瓶中。
将样品管放入TURBIDI.T™测量腔中，进行测量。测量结果由 Soft Matter Analytics™ 应用程序显示。
通过使用相关曲线（细胞数/毫升与 FTU），FTU 与细胞密度相关联。
细胞浓度是根据曲线方程计算得出的。

图5： 一种用于估算含浊度液体培养基中细胞浓度的方法。

结论与展望

借助操作简便的TURBIDI.T™仪器，可以轻松测定液体培养基中酵母细胞的浊度。
用户可在TURBIDI.T™中选择不同波长的发光，以更好地适应颗粒或细胞的类型和大小。对于有色溶液，实践表明 850 nm 是最精确的波长，因为样品的吸光度不会影响测量结果。
使用传统计数板进行的细胞计数分析与浊度值高度相关（R²=0.998），这表明可以轻松开发并有效应用一种用于估算培养基中细胞数量的推断方法。
TURBIDI.T™的快速采集功能结合易于使用的 Soft Matter Analytics™ 应用程序，可帮助用户通过浊度快速定量分析细胞，从而在需要进行常规细胞计数测量时，为实验室节省时间和资源。