Nota applicativa | TURBIDI.T™
Come Misurare la Concentrazione Cellulare con la Torbidità?
di Gloria Pinilla e Nora Kasaplar,
Applicazione Scienziati, Rheolution Inc.
In collaborazione con
Scuola Nazionale Superiore di Tecnologia delle Biomolecole di Bordeaux (ENSTBB).
Sintesi
- La crescente richiesta di metodi più rapidi per la quantificazione cellulare va oltre le tradizionali camere di conteggio, spingendo verso soluzioni innovative che consentono un conteggio accurato riducendo i tempi.
- La torbidità, che riflette l’opacità della soluzione dovuta alla presenza di particelle che diffondono la luce, si rivela un metodo efficace per accelerare la quantificazione delle cellule.
- In questa nota applicativa è stata stabilita una forte correlazione tra la torbidità (FTU) di una soluzione di coltura di S. cerevisiae e il numero di cellule (cellule/mL) contato con una camera di conteggio cellulare convenzionale.
- L’uso di TURBIDI.T™ per misurazioni accurate della torbidità offre un metodo semplice e veloce per stimare il numero di cellule, facendoti risparmiare tempo e risorse nel conteggio cellulare di routine.
ALLE ESPLORAZIONE DI ALTERNATIVE NEL CONTAGGIO DELLE CELLULE TRAMITE LA MISURAZIONE DELLA TURBIDITÀ
Introduzione
Nel campo dell’analisi delle colture cellulari, la necessità di metodi efficienti per la quantificazione delle cellule ha portato alla ricerca di alternative alla tecnica tradizionale delle camere di conteggio, che richiede molto tempo. Questo approccio convenzionale, pur essendo affidabile, presenta alcune difficoltà in termini di velocità e praticità, soprattutto alla luce delle crescenti esigenze del mondo della ricerca e dell’industria.
La torbidità, che misura il grado di opacità di una soluzione, si rivela un approccio interessante per accelerare la quantificazione delle cellule. Il livello di torbidità in un mezzo è stato associato alla concentrazione cellulare all’interno di una coltura cellulare [1]. Sfruttando questa correlazione, questa nota applicativa presenta un nuovo approccio per determinare rapidamente il numero di cellule. Questo metodo sfrutta le funzionalità di TURBIDI.T™, uno strumento connesso all’IoT progettato per misurare con precisione la torbidità. Grazie a questo strumento, ti presentiamo una tecnica pratica ed efficiente per stimare il numero di cellule sulla base delle misurazioni della torbidità, che rappresenta un significativo passo avanti nelle metodologie di quantificazione cellulare.
Figura 1: Relazione tra torbidità e concentrazione cellulare. Una bassa concentrazione cellulare comporta un’elevata trasmissione della luce attraverso il campione, che viene rilevata come bassa torbidità (a sinistra), mentre un’alta concentrazione cellulare comporta una minore trasmissione della luce, rilevata come valori elevati di torbidità nel campione. Le frecce blu indicano la direzione della luce.
METODOLOGIA PER IL CONTAGGIO DELLE CELLULE TRAMITE TECNICHE DI TURBIDITÀ E DI COLORAZIONE
Materiali e metodi
Le cellule di Saccharomyces cerevisiae (5-10 µm) sono state coltivate in un bioreattore (BIOSTAT B; Sartorius Stedim Biotech, Göttingen, Germania) come spiegato nella nostra precedente nota applicativa (Figura 2).
Figura 2: Configurazione del bioreattore per la coltura del lievito in condizioni sterili.
Il lievito è stato inoculato nel bioreattore a partire da una precultura di lievito coltivata in precedenza durante la notte. È stato inoculato un volume di 100 mL per ottenere un valore iniziale di torbidità pari a 200 FTU. Dopo l’inoculazione, ogni due ore sono state prelevate aliquote sterili e il numero di cellule (cioè la concentrazione cellulare) è stato determinato con il metodo di colorazione al blu di metilene. Questo metodo si basa su un colorante, il blu di metilene, che si lega ai componenti cellulari e li tinge di blu. Questo colorante reagisce in modo diverso nelle cellule vive e in quelle morte, poiché viene metabolizzato dalle cellule vive (che rimangono incolori), mentre le cellule morte rimangono colorate di blu. Le cellule colorate sono state poste su un emocitometro (detto anche camera di conteggio cellulare o camera di Malassez) e osservate al microscopio (x40). L’emocitometro è composto da nove quadrati di 1 x 1 mm (1 mm²). Per ogni misurazione è stato utilizzato un volume di 1 µL.
La torbidità delle soluzioni è stata determinata utilizzando TURBIDI.T™. Lo strumento è stato calibrato con standard di formazina (1-4000 FTU). L’emissione e la ricezione della luce sono state effettuate utilizzando rispettivamente le cartucce Emitt.805 (850 nm) e Receiv.ViS (lunghezza d’onda compresa tra 400 nm e 1000 nm). Abbiamo usato una lunghezza d’onda di 850 nm perché l’assorbimento della luce da parte del campione era minore (dati non riportati). In questo lavoro abbiamo scelto di usare fiale da 10 mL, nelle quali i campioni sono stati suddivisi in aliquote e misurati con il TURBIDI.T™. I dati sono stati raccolti e visualizzati sul tablet su cui era in esecuzione l’app Soft Matter Analytics App™.
Sia il conteggio delle cellule che le misurazioni della torbidità sono stati effettuati in triplicato (n=3). I dati sono riportati come media ± deviazione standard. La variabilità è definita come il rapporto tra la deviazione standard e il valore medio.
ANALISI COMPARATIVA E CORRELAZIONE TRA I PARAMETRI DI TURBIDITÀ E DI CONTEGGIO CELLULARE
Risultati e discussione
Abbiamo analizzato alcune aliquote cellulari della coltura di lievito in fase di crescita misurando la torbidità e contando le cellule con una camera di conteggio. La figura 3 mostra l’andamento nel tempo di entrambi i parametri, che aumentano col passare del tempo. Dal grafico si vede che l’andamento della torbidità e della concentrazione cellulare seguono la stessa tendenza, che nel complesso è esponenziale. L’aumento della concentrazione cellulare influisce direttamente sulla torbidità della coltura. Un numero maggiore di cellule diffonde la luce e incide sulla torbidità complessiva del terreno di coltura.
Le misurazioni della torbidità sono risultate più coerenti (con una variabilità del 3,8%) rispetto alla tecnica di conteggio cellulare (con una variabilità del 17,6%). Questa divergenza può essere attribuita a imprecisioni nel conteggio dovute alla percezione umana, ma anche alla differenza nel volume del campione tra i due metodi. Mentre il conteggio delle cellule utilizza 1 µL di campione, in questo studio la valutazione della torbidità viene condotta utilizzando aliquote da 10 mL. Soprattutto quando si ha a che fare con bioreattori di grandi volumi (come nel nostro caso, 2 L), un volume di campione più consistente contribuisce a dare un quadro più completo dei processi in atto nella coltura cellulare, fornendo così una stima più accurata.
Figura 3: Andamento nel tempo, durante la coltura di S. cerevisiae, di (A) torbidità (FTU) e (B) concentrazione cellulare (cellule/mL) misurata con una camera di conteggio cellulare.
La figura 4 mostra la correlazione lineare tra le misurazioni della torbidità e il conteggio delle cellule al microscopio. La curva è rappresentata dall’equazione: y = 32 345x – 4 894 248 e ha un coefficiente di determinazione R² = 0,998.
Figura 4: Correlazione tra il numero di cellule contato con una camera di conteggio cellulare e la torbidità misurata con TURBIDI.T™
È interessante notare che si possono creare grafici simili utilizzando diversi terreni di coltura e tipi di cellule microbiche per mettere in evidenza questa correlazione. Il grafico ottenuto può poi essere usato per stimare il numero di cellule in un campione, semplicemente mettendo in relazione il valore di torbidità misurato con TURBIDI.T™ al numero di cellule corrispondente. Questo metodo di inferenza si articola in quattro fasi successive (Figura 5):
- Un campione contenente una concentrazione sconosciuta di cellule viene suddiviso in aliquote in una o più fiale.
- La fiala viene inserita nella camera del TURBIDI.T™ e si esegue una misurazione. I risultati vengono visualizzati dall’app Soft Matter Analytics™.
- Utilizzando la curva di correlazione (cellule/mL vs. FTU), le FTU vengono associate a una densità cellulare.
- La concentrazione cellulare si calcola usando l’equazione della curva.
Figura 5: Un metodo per stimare la concentrazione cellulare in un terreno di coltura liquido con torbidità.
Conclusioni e prospettive
- La torbidità delle cellule di lievito in un terreno di coltura liquido può essere misurata facilmente con lo strumento TURBIDI.T™, davvero facile da usare.
- Con il TURBIDI.T™, puoi scegliere diverse lunghezze d’onda di emissione luminosa per adattarti meglio al tipo e alle dimensioni delle particelle o delle cellule. Nel caso di soluzioni colorate, la lunghezza d’onda di 850 nm si è dimostrata la più precisa, poiché l’assorbanza del campione non influisce sui risultati.
- L’analisi del conteggio cellulare effettuata con una camera di conteggio convenzionale presenta un’elevata correlazione con i valori di torbidità (R² = 0,998), a dimostrazione del fatto che è possibile sviluppare facilmente e utilizzare efficacemente un metodo di inferenza per stimare il numero di cellule in un terreno di coltura.
- Le funzionalità di acquisizione rapida di TURBIDI.T™, insieme all’app Soft Matter Analytics™, facile da usare, ti aiutano a quantificare velocemente le cellule tramite la torbidità e, in definitiva, a risparmiare tempo e risorse in laboratorio quando devi fare le misurazioni di routine per il conteggio cellulare.
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Riferimenti
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