Nota applicativa | TURBIDI.T™
Migliorare il monitoraggio della crescita del lievito grazie alla misurazione della torbidità
di Gloria Pinilla e Nora Kasaplar,
Applicazione Scienziati, Rheolution Inc.
In collaborazione con
Scuola Nazionale Superiore di Tecnologia delle Biomolecole di Bordeaux (ENSTBB).
Sintesi
- Il monitoraggio della crescita dei lieviti è un processo fondamentale per garantire condizioni ottimali e la produttività nei processi biotecnologici.
- Le misurazioni basate sulla torbidità si sono affermate come un metodo rapido e non distruttivo per stimare la crescita del lievito e monitorare la densità della coltura nel tempo. TURBIDI.T™ (Rheolution, QC, Canada) è stato utilizzato per monitorare con precisione la crescita di S. cerevisiae nel tempo.
- I risultati relativi alla torbidità (850 nm) e all’assorbanza (600 nm) sono stati messi a confronto, evidenziando andamenti simili e una forte correlazione.
- TURBIDI.T™ ha dimostrato numerosi vantaggi rispetto allo spettrofotometro per quanto riguarda l’analisi della crescita cellulare e la raccolta dei dati.
Progressi nel monitoraggio della crescita del lievito: misurazione della torbidità
Introduzione
Nel campo della bioingegneria e della biotecnologia, le cellule fungono da catalizzatori per la produzione di diversi prodotti di valore, come biocarburanti, farmaci, anticorpi, enzimi industriali e sostanze chimiche di origine biologica [1]. In questo contesto, il lievito, un microrganismo ampiamente utilizzato, svolge un ruolo fondamentale. Monitorare la crescita del lievito è di fondamentale importanza per garantire condizioni ottimali e produttività nei processi biotecnologici [2].
Tradizionalmente, l’analisi spettrofotometrica è stata usata per valutare la densità ottica a 600 nm (OD600nm) misurando l’assorbimento della luce da parte della coltura di lievito e per monitorare l’evoluzione della torbidità di una popolazione cellulare. Le misurazioni basate sulla torbidità si sono affermate come un approccio rapido e non distruttivo per stimare la crescita del lievito e monitorare la densità della coltura nel tempo. Questa metodologia sfrutta i principi della diffusione della luce, in base ai quali le variazioni nella concentrazione e nelle dimensioni delle cellule influenzano l’intensità della luce diffusa dalla coltura. Quantificando la torbidità risultante, si possono ottenere informazioni preziose sull’andamento della crescita cellulare.
Il Saccharomyces cerevisiae (5-10 µm), noto anche come lievito di panificazione o lievito da birra, occupa un posto di rilievo come organismo modello nel campo della produzione industriale. Ciò è dovuto alle sue caratteristiche ben definite, alla sua robustezza, all’elevata produttività e alla sua versatilità.
Questa nota applicativa si concentra sull’uso di TURBIDI.T™ (Rheolution, QC, Canada) per monitorare la crescita di S. cerevisiae nel tempo. I risultati ottenuti vengono confrontati e messi in relazione con le misurazioni di OD a 600 nm effettuate con uno spettrofotometro standard. Analizzando questo confronto, si possono ricavare informazioni preziose per comprendere meglio l’efficacia e l’affidabilità di TURBIDI.T™ come strumento di monitoraggio della crescita del lievito.
Monitoraggio della crescita del lievito tramite la misurazione della torbidità: un caso di studio su S. cerevisiae
Materiali e metodi
È stata preparata una precultura di lievito da 100 mL in condizioni sterili, inoculando colonie di S. cerevisiae provenienti da una coltura solida su una piastra di Petri, seguita da una crescita notturna. Contemporaneamente, è stato preparato un bioreattore da 3 L (BIOSTAT B; Sartorius Stedim Biotech, Göttingen, Germania) contenente terreno di coltura sintetico sterile [3] è stato preparato per la sterilizzazione notturna in autoclave. Il terreno di coltura sintetico era composto da vari sali inorganici ((NH₄)₂SO₄, KH₂PO₄, MgSO₄), vitamine, oligoelementi e glucosio. Dopo la sterilizzazione, le sonde di pH e pO₂, così come la pompa di alimentazione del glucosio, sono state calibrate seguendo le istruzioni fornite dal software del BIOSTAT B (Figura 1).
Figura 1: Configurazione del bioreattore per la coltura del lievito in condizioni sterili.
Per calibrare il TURBIDI.T™, prima di eseguire i test sono stati utilizzati standard di formazina. L’emissione e la ricezione della luce sono state attivate utilizzando rispettivamente le cartucce Emitt.805 (lunghezza d’onda di 850 nm) e Receiv.ViS (lunghezza d’onda compresa tra 400 nm e 1000 nm). Abbiamo scelto di utilizzare la cartuccia da 850 nm poiché l’effetto dell’assorbimento della luce era minore. Lo spettrofotometro (SAFAS UVmc, SAFAS, Monaco) è stato calibrato con una fiala di acqua distillata deionizzata (ddH₂O) prima di ogni misurazione.
I lieviti precoltivati sono stati inoculati nel bioreattore a una densità di 220 FTU (0,21 uOD). Successivamente, la crescita del lievito è stata monitorata prelevando aliquote di coltura ogni ora per 8 ore. Le misurazioni della torbidità a 850 nm (espressa in FTU) e dell’assorbanza (espressa in uOD) sono state effettuate in triplicato per ciascun intervallo di tempo (n=3). Per le misurazioni spettrofotometriche, l’aliquota della coltura di lieviti è stata diluita in rapporto 1:100, mentre per quelle turbidimetriche non è stata necessaria alcuna diluizione e le aliquote sono state analizzate direttamente. I risultati sono presentati come media ± deviazione standard.
Analisi delle dinamiche di crescita del lievito: misurazioni della torbidità rispetto all’assorbanza nelle colture di S. cerevisiae
Risultati e discussione
La figura 2 mostra l’andamento della crescita del lievito nel tempo, con un notevole aumento esponenziale sia in unità di torbidità (FTU) che in unità di assorbanza (uOD) dopo un breve periodo di latenza di 2 ore. Durante la fase di latenza, le cellule di lievito attraversano un periodo di adattamento, adeguandosi gradualmente all’ambiente circostante. Al termine di questa fase, la curva decolla, dimostrando la proliferazione continua delle cellule di lievito. Questa fase di crescita esponenziale indica la presenza di condizioni ottimali per la crescita del lievito, in cui fattori come la disponibilità di nutrienti e gli stimoli ambientali favoriscono la divisione cellulare attiva e l’attività metabolica.
Figura 2: Configurazione del bioreattore per la coltura del lievito in condizioni sterili. Andamento della torbidità di S. cerevisiae coltura per 8 ore e confronto tra la torbidità a 850 nm e l’OD600 nm.
Le misurazioni della torbidità ottenute con TURBIDI.T™ (rappresentate sull’asse Y di sinistra) coincidono perfettamente con i valori di assorbanza ottenuti con uno spettrofotometro standard (visualizzati sull’asse Y di destra), dato che entrambe le curve mostrano un andamento simile. Le deviazioni standard erano tutte molto basse (barre di errore incluse nel grafico), a dimostrazione dell’elevata precisione delle misurazioni (variabilità inferiore all’1%).
In linea con le osservazioni della Figura 2, c’è una correlazione lineare positiva tra la torbidità e le misurazioni dell’OD a 600 nm, con un coefficiente di determinazione (R²) davvero notevole pari a 0,998 (Figura 3). Questo elevato valore di R² indica una relazione forte e affidabile tra la torbidità e l’OD a 600 nm, suggerendo che le misurazioni della torbidità possano effettivamente sostituire quelle basate sull’assorbanza nel monitoraggio della crescita del lievito.
Figura 3: Correlazione tra FTU (850 nm) e uOD (600 nm) nella misurazione della crescita delle colture cellulari.
La stretta corrispondenza tra le misurazioni della torbidità e dell’assorbanza, insieme all’elevato coefficiente di correlazione, evidenzia l’efficacia e l’accuratezza delle misurazioni basate sulla torbidità effettuate con TURBIDI.T™ per monitorare le dinamiche di crescita del lievito.
Inoltre, la possibilità di ottenere dati affidabili sulla crescita senza dover diluire i campioni, come invece richiede l’analisi spettrofotometrica tradizionale, sottolinea ulteriormente i vantaggi offerti dall’approccio basato sulla torbidità. Nel complesso, questi risultati dimostrano il potenziale di TURBIDI.T™ come strumento prezioso per il monitoraggio preciso ed efficiente della crescita del lievito nei bioprocessi, contribuendo ai progressi nella ricerca e nelle applicazioni biotecnologiche.
Conclusioni e prospettive
- Il sistema TURBIDI.T™ si è dimostrato uno strumento potente e preciso per monitorare la crescita e la cinetica delle colture cellulari nelle colture di lievito.
- Il confronto tra la torbidità e l’OD a 600 nm mostra una forte relazione lineare, confermando la torbidità come un’alternativa precisa alle misurazioni basate sull’assorbanza. Questo mette in evidenza l’efficacia della torbidità nel valutare con precisione le dinamiche di crescita del lievito.
- TURBIDI.T™ offre diversi vantaggi rispetto all’analisi spettrofotometrica. L’eliminazione della diluizione del campione, grazie all’ampio intervallo di valori di torbidità rilevati dallo strumento TURBIDI.T™, riduce gli errori di misurazione e fa risparmiare tempo prezioso. Inoltre, il tablet portatile permette di raccogliere e archiviare facilmente i dati, migliorando la praticità e l’accessibilità.
- La versatilità del sistema TURBIDI.T™ permette di utilizzare diverse fiale per le misurazioni in base alle diverse configurazioni sperimentali.
- La scalabilità del sistema TURBIDI.T™ ne aumenta ulteriormente il valore. Collegando più unità a un unico tablet di comando si migliora l’efficienza dei test, consentendo misurazioni simultanee in esperimenti su larga scala.
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