Note d'application | TURBIDI.T™
Améliorer le suivi de la croissance des levures grâce à la mesure de la turbidité
par Gloria Pinilla et Nora Kasaplar,
Application Chercheurs, Rheolution Inc.
En collaboration avec
École nationale supérieure de technologie des biomolécules de Bordeaux (ENSTBB).
Résumé
- Le suivi de la croissance des levures est un processus essentiel pour garantir des conditions optimales et une productivité maximale dans les procédés biotechnologiques.
- Les mesures basées sur la turbidité se sont imposées comme une méthode rapide et non destructive permettant d’estimer la croissance des levures et de suivre l’évolution de la densité de culture au fil du temps. Le système TURBIDI.T™ (Rheolution, QC, Canada) a été utilisé pour suivre avec précision la croissance de S. cerevisiae au fil du temps.
- Les résultats relatifs à la turbidité (850 nm) et à l’absorbance (600 nm) ont été comparés, ce qui a permis de mettre en évidence des tendances similaires et une forte corrélation.
- TURBIDI.T™ a démontré de nombreux avantages par rapport au spectrophotomètre en matière d’analyse de la croissance cellulaire et de collecte de données.
Progrès en matière de suivi de la croissance des levures : mesure de la turbidité
Introduction
Dans le domaine de la bio-ingénierie et de la biotechnologie, les cellules jouent un rôle de catalyseurs dans la production de divers produits de grande valeur, tels que les biocarburants, les produits pharmaceutiques, les anticorps, les enzymes industrielles et les produits chimiques d’origine biologique [1]. Dans ce contexte, la levure, un micro-organisme largement utilisé, joue un rôle central. Le suivi de la croissance de la levure revêt une importance capitale pour garantir des conditions et une productivité optimales dans les procédés biotechnologiques [2].
Traditionnellement, l’analyse spectrophotométrique est utilisée pour évaluer la densité optique à 600 nm (DO600 nm) en mesurant l’absorption de la lumière par la culture de levure, ainsi que pour suivre l’évolution de la turbidité d’une population cellulaire. Les mesures basées sur la turbidité se sont imposées comme une approche rapide et non destructive pour estimer la croissance des levures et suivre la densité de la culture au fil du temps. Cette méthodologie s’appuie sur les principes de la diffusion de la lumière, selon lesquels les variations de concentration et de taille des cellules influencent l’intensité de la lumière diffusée par la culture. La quantification de la turbidité ainsi obtenue permet d’obtenir des informations précieuses sur la progression de la croissance cellulaire.
Saccharomyces cerevisiae (5 à 10 µm), également connu sous le nom de levure de boulangerie ou de levure de bière, occupe une place prépondérante en tant qu’organisme modèle dans le domaine de la production industrielle. Cela s’explique par sa nature bien caractérisée, sa robustesse, sa forte productivité et sa polyvalence.
La présente note d’application porte sur l’utilisation du TURBIDI.T™ (Rheolution, QC, Canada) pour suivre la croissance de S. cerevisiae au fil du temps. Les résultats obtenus sont comparés et mis en corrélation avec les mesures de DO600 nm réalisées à l’aide d’un spectrophotomètre standard. L’examen de cette comparaison permet de tirer des enseignements précieux pour mieux comprendre l’efficacité et la fiabilité de TURBIDI.T™ en tant qu’outil de suivi de la croissance des levures.
Suivi de la croissance des levures par la mesure de la turbidité : une étude de cas sur S. cerevisiae
Matériel et méthodes
Une préculture de levure de 100 ml a été préparée dans des conditions stériles en ensemencant des colonies de S. cerevisiae issues d’une culture solide sur une boîte de Pétri, puis en laissant la culture se développer pendant une nuit. Parallèlement, un bioréacteur de 3 l (BIOSTAT B ; Sartorius Stedim Biotech, Göttingen, Allemagne) contenant un milieu de culture synthétique stérile [3] a été préparé en vue d’une stérilisation pendant la nuit dans un autoclave. Le milieu de culture synthétique était composé de divers sels inorganiques ((NH₄)₂SO₄, KH₂PO₄, MgSO₄), de vitamines, d’oligo-éléments et de glucose. Après stérilisation, les sondes de pH et de pO₂, ainsi que la pompe d’alimentation en glucose, ont été étalonnées conformément aux instructions fournies par le logiciel du BIOSTAT B (figure 1).
Figure 1 : Montage du bioréacteur destiné à la culture de levures dans des conditions stériles.
Pour étalonner le TURBIDI.T™, des étalons à base de formazine ont été utilisés avant les essais. L’émission et la réception de la lumière ont été assurées respectivement à l’aide de cartouches Emitt.805 (longueur d’onde de 850 nm) et de cartouches Receiv.ViS (longueur d’onde comprise entre 400 nm et 1 000 nm). Nous avons choisi d’utiliser la cartouche de 850 nm car l’effet d’absorption de la lumière y était moindre. Le spectrophotomètre (SAFAS UVmc, SAFAS, Monaco) a été étalonné à l’aide d’un flacon d’eau distillée déionisée (ddH₂O) avant chaque mesure.
Les levures pré-cultivées ont été ensemencées dans le bioréacteur à une densité de 220 FTU (0,21 uOD). Par la suite, la croissance des levures a été suivie en prélevant des aliquotes de levures toutes les heures pendant 8 heures. Les mesures de turbidité à 850 nm (exprimées en FTU) et d’absorbance (exprimées en uOD) ont été réalisées en trois réplicats pour chaque temps de mesure (n = 3). Pour les mesures spectrophotométriques, l’aliquote de culture de levure a été diluée dans un rapport de 1:100, tandis que pour les mesures turbidimétriques, aucune dilution n’a été nécessaire et les aliquotes ont été analysées directement. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± écart-type.
Analyse de la dynamique de croissance de la levure : comparaison entre les mesures de turbidité et d'absorbance dans des cultures de S. cerevisiae
Résultats et discussion
La figure 2 illustre l’évolution de la croissance de la levure au fil du temps, montrant une augmentation exponentielle notable tant en unités de turbidité (FTU) qu’en unités d’absorbance (uOD) après une courte période de latence de 2 heures. Au cours de la phase de latence, les cellules de levure traversent une période d’adaptation, s’ajustant progressivement à leur environnement. À la fin de cette phase, la courbe s’accélère, illustrant la prolifération continue des cellules de levure. Cette phase de croissance exponentielle indique la présence de conditions optimales pour la croissance de la levure, dans lesquelles des facteurs tels que la disponibilité des nutriments et les signaux environnementaux favorisent une division cellulaire active et une activité métabolique intense.
Figure 2 : Mise en place d’un bioréacteur pour la culture de levures dans des conditions stériles. Évolution de la turbidité de S. cerevisiae culture pendant 8 h et comparaison entre la turbidité à 850 nm et la DOà 600 nm.
Les mesures de turbidité obtenues à l’aide de TURBIDI.T™ (représentées sur l’axe Y de gauche) concordent étroitement avec les valeurs d’absorbance obtenues à l’aide d’un spectrophotomètre standard (affichées sur l’axe Y de droite), les deux courbes présentant une tendance similaire. Les écarts-types étaient tous très faibles (barres d’erreur incluses dans le graphique), ce qui démontre la grande précision des mesures (variabilité inférieure à 1 %).
Conformément aux observations de la figure 2, il existe une corrélation linéaire positive entre la turbidité et les mesures de la DO600 nm, avec un coefficient de détermination (R²) impressionnant de 0,998 (figure 3). Cette valeur élevée de R² indique une relation forte et fiable entre la turbidité et l’OD à 600 nm, ce qui suggère que les mesures de turbidité peuvent efficacement se substituer aux mesures basées sur l’absorbance lors du suivi de la croissance des levures.
Figure 3 : Corrélation entre la FTU (850 nm) et l’uOD (600 nm) dans la mesure de la croissance d’une culture cellulaire.
La forte concordance entre les mesures de turbidité et d’absorbance, associée à un coefficient de corrélation élevé, met en évidence l’efficacité et la précision des mesures basées sur la turbidité réalisées à l’aide de TURBIDI.T™ pour le suivi de la dynamique de croissance des levures.
De plus, la possibilité d’obtenir des données fiables sur la croissance sans avoir à diluer les échantillons, comme l’exige l’analyse spectrophotométrique traditionnelle, met encore davantage en évidence les avantages offerts par l’approche fondée sur la turbidité. Dans l’ensemble, ces résultats démontrent le potentiel de TURBIDI.T™ en tant qu’outil précieux pour un suivi précis et efficace de la croissance des levures dans les bioprocédés, contribuant ainsi aux progrès de la recherche et des applications biotechnologiques.
Conclusions et perspectives
- Le système TURBIDI.T™ s’est révélé être un outil performant et précis pour le suivi de la croissance et de la cinétique des cultures cellulaires dans les cultures de levure.
- La comparaison entre la turbidité et l’OD à 600 nm révèle une forte relation linéaire, ce qui fait de la turbidité une alternative précise aux mesures basées sur l’absorbance. Cela met en évidence l’efficacité de la turbidité pour évaluer avec précision la dynamique de croissance des levures.
- Le TURBIDI.T™ présente plusieurs avantages par rapport à l’analyse par spectrophotomètre. L’absence de dilution des échantillons, grâce à la large plage de valeurs de turbidité mesurées par l’appareil TURBIDI.T™, réduit les erreurs de mesure et permet de gagner un temps précieux. De plus, la tablette portable facilite la collecte et le stockage des données, ce qui améliore le confort d’utilisation et l’accessibilité.
- La polyvalence du système TURBIDI.T™ permet d’utiliser différents flacons pour effectuer des mesures dans le cadre de divers montages expérimentaux.
- L’évolutivité du système TURBIDI.T™ renforce encore davantage sa valeur ajoutée. Le fait de connecter plusieurs unités à une seule tablette de commande améliore l’efficacité des essais, permettant ainsi d’effectuer des mesures simultanées dans le cadre d’expériences à plus grande échelle.
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Références
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