Yeast Growth Monitoring with TURBIDI.T™ in Bioreactor - Blog Post Image

アプリケーションノート | TURBIDI.T™

濁度測定による酵母の増殖モニタリングの高度化

by Gloria Pinilla and Nora Kasaplar,

応用科学者、 Rheolution Inc.

協力：

ボルドー国立生体分子技術高等学院（ENSTBB）。

概要

酵母の増殖をモニタリングすることは、バイオテクノロジープロセスにおいて最適な条件と生産性を確保するために不可欠なプロセスである。
濁度に基づく測定法は、酵母の増殖を推定し、経時的な培養密度を追跡するための迅速かつ非破壊的な手法として注目されています。TURBIDI.T™（Rheolution社、カナダ・ケベック州）は、S. cerevisiaeの経時的な増殖を正確にモニタリングするために使用されています。
濁度（850 nm）と吸光度（600 nm）の測定結果を比較したところ、同様の傾向が見られ、強い相関関係が確認された。
TURBIDI.T™は、細胞増殖の解析やデータ収集において、分光光度計に比べて多くの利点があることが実証されています。

酵母の増殖モニタリングにおける進歩：濁度測定

はじめに

バイオエンジニアリングおよびバイオテクノロジーの分野において、細胞は、バイオ燃料、医薬品、抗体、工業用酵素、バイオ由来化学物質など、さまざまな高付加価値製品の生産における触媒としての役割を果たしている[1]。こうした状況において、広く利用されている微生物である酵母は、極めて重要な役割を果たしている。バイオテクノロジープロセスにおいて最適な条件と生産性を確保するためには、酵母の増殖をモニタリングすることが極めて重要である[2]。

従来、分光光度法を用いた分析では、酵母培養液による光の吸収を測定することで600 nmにおける光学密度（OD600nm）を評価し、細胞集団の濁度の変化をモニタリングしてきました。濁度に基づく測定法は、酵母の増殖を推定し、経時的な培養密度を追跡するための、迅速かつ非破壊的な手法として登場しました。この手法は光散乱の原理を利用しており、細胞濃度やサイズの変化が培養液によって散乱される光の強度に影響を与えます。その結果として生じる濁度を定量化することで、細胞増殖の進行に関する貴重な知見を得ることができます。

Saccharomyces cerevisiae（5～10 µm）は、パン酵母またはビール酵母としても知られ、工業生産の分野においてモデル生物として重要な位置を占めている。これは、その特性が十分に解明されていること、耐性の高さ、高い生産性、そして汎用性の高さによるものである。

本アプリケーションノートでは、TURBIDI.T™（Rheolution社、カナダ・ケベック州）を用いて、S. cerevisiaeの経時的な増殖をモニタリングする方法に焦点を当てています。得られた結果は、標準的な分光光度計を用いて測定したOD600nm値と比較・相関分析されます。この比較を検討することで、酵母の増殖モニタリングツールとしてのTURBIDI.T™の有効性と信頼性をさらに理解するための貴重な知見が得られます。

濁度測定による酵母の増殖モニタリング：S. cerevisiae を対象とした事例研究

材料および方法

無菌条件下で、ペトリ皿上の固体培養物からS. cerevisiaeのコロニーを接種し、一晩培養することで、100 mLの酵母予備培養液を調製した。同時に、無菌の合成培養液[3]を入れた3 Lのバイオリアクター（BIOSTAT B； Sartorius Stedim Biotech社製、ドイツ・ゲッティンゲン）に無菌の合成培養液[3]を充填し、オートクレーブ内で一晩にわたる滅菌を行う準備を整えた。合成培養液は、各種無機塩（(NH₄)₂SO₄、KH₂PO₄、MgSO₄）、ビタミン、微量元素、およびグルコースから構成されていた。滅菌後、BIOSTAT Bソフトウェアの指示に従って、pHおよびpO₂プローブ、ならびにグルコース供給ポンプの校正を行った（図1）。

図1： 無菌条件下での酵母培養用のバイオリアクター の構成。

TURBIDI.T™の校正には、試験に先立ちフォルマジン標準液を用いた。発光および受光は、それぞれ Emitt.805 カートリッジ（波長 850 nm）および Receiv.ViS カートリッジ（波長範囲 400 nm～1000 nm）を使用して行いました。光吸収の影響が小さかったため、850 nm のカートリッジを使用することにしました。分光光度計（SAFAS UVmc、SAFAS、モナコ）は、各測定の前に、脱イオン蒸留水（ddH2O）1 バイアルを用いて校正しました。

予備培養した酵母を、220 FTU（0.21 uOD）の密度でバイオリアクターに接種した。その後、8時間にわたり1時間ごとに酵母の分注液を採取し、酵母の増殖をモニタリングした。850 nmにおける濁度（FTUで表示）および吸光度（uODで表示）の測定は、各時点について3回ずつ（n=3）実施した。分光光度法による測定では、酵母培養液の分取液を 1:100 の比率で希釈したが、濁度測定では希釈は不要であり、分取液を直接測定した。結果は平均値 ± 標準偏差として示されている。

酵母の増殖動態の解析：S. cerevisiae培養液における濁度測定と吸光度測定の比較

結果と考察

図2は、時間経過に伴う酵母の増殖パターンを示しており、2時間の短い潜伏期の後、濁度単位（FTU）および吸光度単位（uOD）の両方で顕著な指数関数的増加が見られる。潜伏期の間、酵母細胞は適応期間を経て、徐々に環境に適応していく。この段階が終わると、曲線は急上昇し、酵母細胞の継続的な増殖を示している。この指数関数的増殖期は、酵母の増殖に最適な条件が整っていることを示しており、栄養素の利用可能性や環境シグナルなどの要因が、活発な細胞分裂と代謝活動を促進している。

図2：無菌条件下での酵母培養のためのバイオリアクターのセットアップ。の濁度の経時変化 S. cerevisiae 8時間培養後の培養液について、850 nmにおける濁度とOD600 nmの比較。

TURBIDI.T™を用いて測定した濁度（左側のY軸に表示）は、標準的な分光光度計を用いて測定した吸光度（右側のY軸に表示）と密接に一致しており、両方の曲線は同様の傾向を示しています。標準偏差はいずれも極めて小さく（グラフには誤差棒が含まれています）、測定の高精度（変動率1%未満）が実証されています。

図2の観察結果と一致して、濁度とOD600nmの測定値の間には正の線形相関が見られ、決定係数（R²）は0.998という極めて高い値を示している（図3）。この高いR²値は、濁度とOD600nmの間に強固かつ信頼性の高い関係があることを示しており、酵母の増殖をモニタリングする際、濁度測定が吸光度に基づく測定の有効な代替手段となり得ることを示唆している。

図3： 細胞培養の増殖測定におけるFTU（850 nm）とuOD（600 nm）の相関関係 。

濁度測定値と吸光度測定値の間に見られる密接な対応関係、および高い相関係数は、酵母の増殖動態をモニタリングする上で、TURBIDI.T™を用いた濁度ベースの測定法の有効性と精度を浮き彫りにしている。

さらに、従来の分光光度法分析で必要とされるような試料の希釈を必要とせずに、信頼性の高い増殖データを取得できる点は、濁度に基づくアプローチが持つ利点をさらに際立たせています。全体として、これらの知見は、TURBIDI.T™がバイオプロセスにおける酵母の増殖を正確かつ効率的にモニタリングするための有用なツールとしての可能性を示しており、バイオテクノロジーの研究および応用の進展に寄与するものである。

結論と展望

TURBIDI.T™システムは、酵母培養における細胞培養の増殖および動態をモニタリングするための、強力かつ高精度なツールであることが示された。
濁度とOD600nmの比較からは、強い直線的な相関関係が認められ、濁度が吸光度に基づく測定に代わる正確な手法であることが明らかになった。これは、酵母の増殖動態を正確に評価する上で、濁度が有効であることを示している。
TURBIDI.T™は、分光光度計による分析と比較して、いくつかの利点があります。TURBIDI.T™装置が測定可能な濁度値の範囲が広いため、試料の希釈が不要となり、測定誤差を低減できるほか、貴重な時間を節約できます。さらに、携帯型のタブレット端末により、データの収集や保存が容易に行えるため、利便性とアクセス性が向上します。
TURBIDI.T™システムの汎用性により、さまざまな実験構成に合わせた測定用に、異なるバイアルに対応することが可能です。
TURBIDI.T™システムの拡張性は、その価値をさらに高めています。複数のユニットを1台の操作用タブレットに接続することで、試験効率が向上し、より大規模な実験における同時測定が可能になります。