Nota de Aplicação | TURBIDI.T™
Aprimorando o monitoramento do crescimento de leveduras por meio da medição da turbidez
por Gloria Pinilla e Nora Kasaplar,
Cientistas de Aplicação, Rheolution Inc.
Em colaboração com
Escola Nacional Superior de Tecnologia de Biomoléculas de Bordeaux (ENSTBB).
Resumo
- O monitoramento do crescimento de leveduras é um processo crucial para garantir condições ideais e produtividade nos processos biotecnológicos.
- As medições baseadas na turbidez têm se destacado como uma abordagem rápida e não destrutiva para estimar o crescimento de leveduras e acompanhar a densidade da cultura ao longo do tempo. O TURBIDI.T™ (Rheolution, QC, Canadá) tem sido utilizado para monitorar com precisão o crescimento de S. cerevisiae ao longo do tempo.
- Os resultados de turbidez (850 nm) e absorvância (600 nm) foram comparados, demonstrando tendências semelhantes e forte correlação.
- O TURBIDI.T™ demonstrou diversas vantagens em relação ao espectrofotômetro no que diz respeito à análise do crescimento celular e à coleta de dados.
Avanços no monitoramento do crescimento de leveduras: medição da turbidez
Introdução
No campo da bioengenharia e da biotecnologia, as células atuam como catalisadoras na produção de diversos produtos valiosos, tais como biocombustíveis, produtos farmacêuticos, anticorpos, enzimas industriais e produtos químicos de base biológica [1]. Nesse contexto, a levedura, um microrganismo amplamente utilizado, desempenha um papel fundamental. O monitoramento do crescimento da levedura é de extrema importância para garantir condições ideais e produtividade nos processos biotecnológicos [2].
Tradicionalmente, a análise espectrofotométrica tem sido utilizada para avaliar a densidade óptica a 600 nm (OD600nm) por meio da medição da absorção de luz pela cultura de levedura, bem como para monitorar a evolução da turbidez de uma população celular. As medições baseadas na turbidez surgiram como uma abordagem rápida e não destrutiva para estimar o crescimento da levedura e acompanhar a densidade da cultura ao longo do tempo. Essa metodologia aproveita os princípios da dispersão da luz, nos quais as mudanças na concentração e no tamanho das células influenciam a intensidade da luz dispersada pela cultura. Ao quantificar a turbidez resultante, é possível obter informações valiosas sobre a progressão do crescimento celular.
A Saccharomyces cerevisiae (5-10 µm), também conhecida como levedura de padeiro ou levedura de cerveja, ocupa uma posição de destaque como organismo-modelo no campo da produção industrial. Isso se deve à sua natureza bem caracterizada, robustez, alta produtividade e versatilidade.
Esta nota de aplicação enfoca o uso do TURBIDI.T™ (Rheolution, QC, Canadá) para monitorar o crescimento de S. cerevisiae ao longo do tempo. Os resultados obtidos são comparados e correlacionados com medições de OD600 nm realizadas por meio de um espectrofotômetro padrão. Ao analisar essa comparação, é possível obter informações valiosas para compreender melhor a eficácia e a confiabilidade do TURBIDI.T™ como ferramenta de monitoramento do crescimento de leveduras.
Monitoramento do crescimento de leveduras por meio da medição da turbidez: um estudo de caso sobre S. cerevisiae
Materiais e Métodos
Preparou-se uma pré-cultura de levedura de 100 mL em condições estéreis, por meio da inoculação de colônias de S. cerevisiae provenientes de uma cultura sólida em placa de Petri, seguida de crescimento durante a noite. Simultaneamente, preparou-se um biorreator de 3 L (BIOSTAT B; Sartorius Stedim Biotech, Göttingen, Alemanha) contendo meio de cultura sintético estéril [3] foi preparado para esterilização durante a noite em uma autoclave. O meio de cultura sintético consistia em vários sais inorgânicos ((NH₄)₂SO₄, KH₂PO₄, MgSO₄), vitaminas, oligoelementos e glicose. Após a esterilização, as sondas de pH e pO₂, bem como a bomba de alimentação de glicose, foram calibradas seguindo as instruções fornecidas pelo software do BIOSTAT B (Figura 1).
Figura 1: Configuração do biorreator para o cultivo de leveduras em condições estéreis.
Para calibrar o TURBIDI.T™, foram utilizados padrões de formazina antes dos testes. A emissão e a recepção de luz foram ativadas utilizando cartuchos Emitt.805 (comprimento de onda de 850 nm) e cartuchos Receiv.ViS (comprimento de onda variando de 400 nm a 1.000 nm), respectivamente. Optamos por utilizar o cartucho de 850 nm, uma vez que o efeito da absorção de luz era menor. O espectrofotômetro (SAFAS UVmc, SAFAS, Mônaco) foi calibrado com um frasco de água destilada desionizada (ddH₂O) antes de cada medição.
As leveduras pré-cultivadas foram semeadas no biorreator a uma densidade de 220 FTU (0,21 uOD). Posteriormente, o crescimento das leveduras foi monitorado por meio da coleta de alíquotas a cada hora, durante 8 horas. As medições de turbidez a 850 nm (expressas em FTU) e de absorvância (expressas em uOD) foram realizadas em triplicata para cada ponto temporal (n = 3). Para as medições espectrofotométricas, a alíquota da cultura de leveduras foi diluída na proporção de 1:100, enquanto que, para as medições turbidimétricas, não foi necessária diluição, e as alíquotas foram testadas diretamente. Os resultados são apresentados como média ± desvio-padrão.
Análise da dinâmica de crescimento da levedura: medições de turbidez versus absorvância em culturas de S. cerevisiae
Resultados e Discussão
A Figura 2 ilustra o padrão de crescimento da levedura ao longo do tempo, apresentando um aumento exponencial notável tanto em unidades de turbidez (FTU) quanto em unidades de absorvância (uOD), após um curto período de latência de 2 horas. Durante a fase de latência, as células de levedura passam por um período de adaptação, ajustando-se gradualmente ao ambiente. À medida que essa fase chega ao fim, a curva decola, demonstrando a proliferação contínua das células de levedura. Essa fase de crescimento exponencial indica a presença de condições ideais para o crescimento da levedura, nas quais fatores como a disponibilidade de nutrientes e os estímulos ambientais promovem a divisão celular ativa e a atividade metabólica.
Figura 2: Configuração do biorreator para o cultivo de leveduras em condições estéreis. Evolução da turbidez de S. cerevisiae cultura durante 8 horas e comparação entre a turbidez a 850 nm e a DO600 nm.
As medições obtidas com o TURBIDI.T™ para a turbidez (representadas no eixo Y à esquerda) correspondem estreitamente aos valores de absorvância obtidos com um espectrofotômetro padrão (exibidos no eixo Y à direita), já que ambas as curvas apresentam uma tendência semelhante. Todos os desvios-padrão foram muito baixos (barras de erro incluídas no gráfico), demonstrando a alta precisão das medições (variabilidade inferior a 1%).
Em consonância com as observações da Figura 2, há uma correlação linear positiva entre a turbidez e as medições de OD600nm, com um impressionante coeficiente de determinação (R²) de 0,998 (Figura 3). Esse alto valor de R² indica uma relação forte e confiável entre a turbidez e a OD600 nm, sugerindo que as medições de turbidez podem servir efetivamente como substituto das medições baseadas na absorvância no monitoramento do crescimento de leveduras.
Figura 3: Correlação entre a FTU (850 nm) e a uOD (600 nm) na medição do crescimento de culturas celulares.
A estreita correspondência entre as medições de turbidez e de absorvância, aliada ao alto coeficiente de correlação, destaca a eficácia e a precisão das medições baseadas na turbidez realizadas com o TURBIDI.T™ para monitorar a dinâmica de crescimento das leveduras.
Além disso, a capacidade de obter dados confiáveis sobre o crescimento sem a necessidade de diluição da amostra — como exigido na análise espectrofotométrica tradicional — reforça ainda mais as vantagens oferecidas pela abordagem baseada na turbidez. De modo geral, esses resultados demonstram o potencial do TURBIDI.T™ como uma ferramenta valiosa para o monitoramento preciso e eficiente do crescimento de leveduras em bioprocessos, contribuindo para avanços na pesquisa e nas aplicações biotecnológicas.
Conclusões e Perspectivas
- O sistema TURBIDI.T™ demonstrou ser uma ferramenta poderosa e precisa para monitorar o crescimento e a cinética de culturas de leveduras.
- A comparação entre a turbidez e o OD600nm revela uma forte relação linear, estabelecendo a turbidez como uma alternativa precisa às medições baseadas na absorvância. Isso destaca a eficácia da turbidez na avaliação precisa da dinâmica de crescimento da levedura.
- O TURBIDI.T™ apresenta diversas vantagens em comparação com a análise por espectrofotômetro. A eliminação da diluição da amostra, devido à ampla faixa de valores de turbidez lidos pelo instrumento TURBIDI.T™, reduz os erros de medição e economiza um tempo valioso. Além disso, o tablet portátil facilita a coleta e o armazenamento de dados, aumentando a conveniência e a acessibilidade.
- A versatilidade do sistema TURBIDI.T™ permite a utilização de diferentes frascos para medições em diversas configurações experimentais.
- A escalabilidade do sistema TURBIDI.T™ aumenta ainda mais seu valor. A conexão de várias unidades a um único tablet operacional melhora a eficiência dos testes, permitindo medições simultâneas em experimentos de maior escala.
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Referências
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