Nota de Aplicação | TURBIDI.T™
Como Medir a Concentração Celular Usando Turbidez?
por Gloria Pinilla e Nora Kasaplar,
Cientistas de Aplicação, Rheolution Inc.
Em colaboração com
Escola Nacional Superior de Tecnologia de Biomoléculas de Bordeaux (ENSTBB).
Resumo
- A crescente demanda por métodos mais rápidos de quantificação celular vai além das câmaras de contagem tradicionais, levando ao desenvolvimento de soluções inovadoras que facilitam a contagem precisa e, ao mesmo tempo, reduzem o tempo necessário.
- A turbidez, que reflete a opacidade da solução na presença de partículas que dispersam a luz, surge como um meio eficaz para acelerar a quantificação celular.
- Nesta nota de aplicação, foi estabelecida uma forte correlação entre a turbidez (FTU) de uma solução de cultura de S. cerevisiae e o número de células (células/mL) contadas com uma câmara de contagem de células convencional.
- O uso do TURBIDI.T™ para medições precisas de turbidez oferece uma abordagem rápida e fácil de usar para estimar o número de células, economizando tempo e recursos na contagem rotineira de células.
EXPLORANDO ALTERNATIVAS NA CONTAGEM DE CÉLULAS POR MEIO DA MEDIÇÃO DA TURBIDIDADE
Introdução
No contexto da análise de culturas celulares, a demanda por métodos eficientes de quantificação celular levou à busca por alternativas à técnica tradicional e demorada das câmaras de contagem de células. Essa abordagem convencional, embora confiável, apresenta desafios em termos de velocidade e praticidade, especialmente diante das crescentes exigências da pesquisa e da indústria.
A turbidez, uma medida da opacidade de uma solução, surge como uma abordagem interessante para acelerar a quantificação celular. O nível de turbidez em um meio tem sido associado à concentração celular em uma cultura celular [1]. Aproveitando essa relação, esta nota de aplicação apresenta uma nova abordagem para determinar rapidamente o número de células. Esse método utiliza os recursos do TURBIDI.T™, um instrumento compatível com a IoT projetado para a medição precisa da turbidez. Ao utilizar essa ferramenta, apresentamos uma técnica prática e eficiente para estimar o número de células com base em medições de turbidez, o que representa um avanço significativo nas metodologias de quantificação celular.
Figura 1: Relação entre a turbidez e a concentração celular. Baixas concentrações celulares resultam em alta transmissão de luz pela amostra, o que é detectado como baixa turbidez (à esquerda), enquanto altas concentrações celulares resultam em menor transmissão de luz, detectada como altos valores de turbidez na amostra. As setas azuis indicam a direção da luz.
METODOLOGIA PARA CONTAGEM DE CÉLULAS POR MEIO DE TÉCNICAS DE TURBIDIDADE E CORAÇÃO
Materiais e Métodos
As células de Saccharomyces cerevisiae (5-10 µm) foram cultivadas em um biorreator (BIOSTAT B; Sartorius Stedim Biotech, Göttingen, Alemanha), conforme explicado em nossa nota de aplicação anterior (Figura 2).
Figura 2: Configuração do biorreator para o cultivo de leveduras em condições estéreis.
A levedura foi inoculada no biorreator a partir de uma pré-cultura de levedura cultivada previamente durante a noite. Foi inoculado um volume de 100 mL, a fim de obter um valor inicial de turbidez de 200 FTU. Após a inoculação, foram coletadas alíquotas estéreis a cada duas horas e o número de células (ou seja, a concentração celular) foi determinado pelo método de coloração com azul de metileno. Esse método se baseia em um corante, o azul de metileno, que se liga aos componentes celulares e os tinge de azul. Esse corante reage de maneira diferente em células viáveis e não viáveis, pois é transformado pelas células vivas (que permanecem incolores), enquanto as células mortas permanecem coradas de azul. As células coradas foram colocadas em um hemocitômetro (também conhecido como câmara de contagem de células ou câmara de Malassez) e observadas ao microscópio (x40). O hemocitômetro é composto por nove quadrados de 1 x 1 mm (1 mm²). Utilizou-se um volume de 1 µL para cada medição.
A turbidez das soluções foi determinada com o uso do TURBIDI.T™. O instrumento foi calibrado com padrões de formazina (1–4.000 FTU). A emissão e a recepção de luz foram realizadas utilizando cartuchos Emitt.805 (850 nm) e cartuchos Receiv.ViS (comprimento de onda variando de 400 nm a 1.000 nm), respectivamente. Utilizou-se um comprimento de onda de 850 nm, uma vez que o efeito da absorção de luz pela amostra era menor (dados não apresentados). Neste trabalho, optamos por utilizar frascos de 10 mL, nos quais as amostras foram alíquotadas e medidas no TURBIDI.T™. Os dados foram coletados e exibidos no tablet no qual estava instalado o aplicativo Soft Matter Analytics App™.
Tanto a contagem de células quanto as medições de turbidez foram realizadas em triplicata (n = 3). Os dados são apresentados como média ± desvio-padrão. A variabilidade é definida como a razão entre o desvio-padrão e o valor médio.
ANÁLISE COMPARATIVA E CORRELAÇÃO ENTRE OS INDICADORES DE TURBIDIDADE E DE CONTAGEM DE CÉLULAS
Resultados e Discussão
Alíquotas celulares na fase de crescimento da cultura de levedura foram analisadas por meio da medição da turbidez e da contagem de células com uma câmara de contagem. A Figura 3 mostra a evolução temporal de ambos os parâmetros, que aumentam com o tempo. Observamos no gráfico que a evolução da turbidez e da concentração celular segue a mesma tendência, que é, em geral, exponencial. O aumento da concentração celular está afetando diretamente a turbidez da cultura. Mais células estão espalhando a luz e afetando a turbidez geral do meio.
As medições de turbidez foram mais consistentes (apresentando 3,8% de variabilidade) em comparação com a técnica de contagem de células (com uma variabilidade de 17,6%). Essa divergência pode ser atribuída a imprecisões na contagem decorrentes da percepção humana, mas também à diferença no volume da amostra entre os dois métodos. Enquanto a contagem de células utiliza 1 µL de amostra, a avaliação da turbidez é realizada neste estudo com alíquotas de 10 mL. Particularmente em cenários que envolvem volumes maiores de biorreatores (como no nosso caso, 2 L), um volume substancial de amostra contribui para uma representação mais abrangente dos processos em andamento na cultura celular, proporcionando, consequentemente, uma estimativa mais precisa.
Figura 3: Evolução ao longo do tempo da cultura de S. cerevisiae da (A) turbidez (FTU) e da (B) concentração celular (células/mL), contadas com uma câmara de contagem de células.
A Figura 4 demonstra a correlação linear entre as medições de turbidez e a contagem de células por microscopia. A curva é representada pela equação: y = 32 345x – 4 894 248 e apresenta um coeficiente de determinação R² = 0,998.
Figura 4: Correlação entre o número de células contadas com uma câmara de contagem celular e a turbidez, utilizando o TURBIDI.T™
É interessante observar que gráficos semelhantes podem ser criados utilizando diferentes meios de cultura e tipos de células microbianas para capturar essa correlação. O gráfico obtido pode então ser utilizado para estimar a contagem de células em uma amostra, bastando para isso correlacionar o valor de turbidez medido com o TURBIDI.T™ ao número de células associado. Esse método de inferência consiste em quatro etapas sucessivas (Figura 5):
- Uma amostra contendo uma concentração desconhecida de células é dividida em alíquotas em (um) ou (vários) frascos.
- O frasco é colocado na câmara do TURBIDI.T™ e é realizada uma medição. Os resultados são exibidos pelo aplicativo Soft Matter Analytics™.
- Com o uso da curva de correlação (células/mL vs. FTUs), as FTUs são associadas a uma densidade celular.
- A concentração celular é calculada por meio da equação da curva.
Figura 5: Um método para estimar a concentração celular em meio de cultura líquido com turbidez.
Conclusões e Perspectivas
- A turbidez das células de levedura em um meio de cultura líquido pode ser facilmente medida com o instrumento TURBIDI.T™, de fácil utilização.
- No TURBIDI.T™, o usuário pode escolher diferentes comprimentos de onda de emissão de luz para se adequar melhor ao tipo e ao tamanho das partículas ou células. No caso de soluções coloridas, o comprimento de onda de 850 nm tem se mostrado o mais preciso, uma vez que a absorvância da amostra não afeta os resultados.
- A análise da contagem de células realizada com uma câmara de contagem convencional apresenta alta correlação com os valores de turbidez (R² = 0,998), demonstrando que é possível desenvolver e utilizar com eficácia um método de inferência para estimar o número de células em um meio de cultura.
- Os recursos de aquisição rápida do TURBIDI.T™, combinados com o aplicativo Soft Matter Analytics™, de fácil utilização, ajudam a quantificar células rapidamente por meio da turbidez e, consequentemente, economizam tempo e recursos no laboratório quando são necessárias medições de contagem celular de rotina.
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Referências
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A determinação do tamanho das partículas é importante em diversas áreas, como as ciências da vida (nanomedicina, administração de medicamentos, engenharia de tecidos, bioanálise), química, ciências ambientais e indústrias. A turbidimetria é um método rápido e não destrutivo para estimar o tamanho das partículas, seguindo um procedimento fácil de executar.