Note d'application | TURBIDI.T™
Comment Mesurer la Concentration Cellulaire par Turbidité ?
par Gloria Pinilla et Nora Kasaplar,
Application Chercheurs, Rheolution Inc.
En collaboration avec
École nationale supérieure de technologie des biomolécules de Bordeaux (ENSTBB).
Résumé
- La demande croissante de méthodes plus rapides de quantification cellulaire dépasse le cadre des chambres de comptage traditionnelles, ce qui donne lieu à des solutions innovantes permettant un comptage précis tout en réduisant le temps nécessaire.
- La turbidité, qui reflète l’opacité d’une solution due à la présence de particules diffusant la lumière, s’avère être un moyen efficace d’accélérer la quantification cellulaire.
- Dans cette note d’application, une forte corrélation a été établie entre la turbidité (FTU) d’une solution de culture de S. cerevisiae et le nombre de cellules (cellules/mL) comptées à l’aide d’une chambre de comptage cellulaire classique.
- L’utilisation de TURBIDI.T™ pour des mesures précises de la turbidité offre une méthode simple et rapide pour estimer le nombre de cellules, ce qui permet de gagner du temps et d’économiser des ressources lors du comptage de routine des cellules.
EXPLORATION DES SOLUTIONS ALTERNATIVES POUR LE COMPTAGE CELLULAIRE PAR MESURE DE LA TURBIDITÉ
Introduction
Dans le cadre de l’analyse des cultures cellulaires, la demande en méthodes efficaces de quantification cellulaire a conduit à la recherche d’alternatives à la technique traditionnelle du comptage à l’aide de chambres de comptage, qui prend beaucoup de temps. Cette approche conventionnelle, bien que fiable, pose des difficultés en termes de rapidité et de praticité, notamment face aux exigences croissantes de la recherche et de l’industrie.
La turbidité, qui mesure le degré de trouble d’une solution, apparaît comme une approche intéressante pour accélérer la quantification cellulaire. Le niveau de turbidité d’un milieu a été associé à la concentration cellulaire au sein d’une culture cellulaire [1]. S’appuyant sur ce lien, la présente note d’application présente une nouvelle approche permettant de déterminer rapidement le nombre de cellules. Cette méthode exploite les capacités de TURBIDI.T™, un instrument connecté à l’Internet des objets (IoT) conçu pour mesurer la turbidité avec précision. Grâce à cet outil, nous proposons une technique pratique et efficace pour estimer le nombre de cellules à partir de mesures de turbidité, ce qui constitue une avancée significative dans les méthodologies de quantification cellulaire.
Figure 1 : Relation entre la turbidité et la concentration cellulaire. Une faible concentration cellulaire entraîne une forte transmission de la lumière à travers l’échantillon, ce qui se traduit par une faible turbidité (à gauche), tandis qu’une concentration cellulaire élevée entraîne une transmission de la lumière plus faible, ce qui se traduit par des valeurs de turbidité élevées dans l’échantillon. Les flèches bleues indiquent la direction de la lumière.
MÉTHODOLOGIE DE COMPTAGE CELLULAIRE PAR TURBIDITÉ ET PAR TECHNIQUES DE COLORATION
Matériel et méthodes
Des cellules de Saccharomyces cerevisiae (5 à 10 µm) ont été cultivées dans un bioréacteur (BIOSTAT B ; Sartorius Stedim Biotech, Göttingen, Allemagne) selon la méthode décrite dans notre note d’application précédente (figure 2).
Figure 2 : Montage du bioréacteur « » destiné à la culture de levures dans des conditions stériles.
La levure a été ensemencée dans le bioréacteur à partir d’une préculture de levure cultivée préalablement pendant une nuit. Un volume de 100 ml a été ensemencé afin d’obtenir une turbidité initiale de 200 FTU. Après l’inoculation, des aliquotes stériles ont été prélevées toutes les deux heures et le nombre de cellules (c’est-à-dire la concentration cellulaire) a été déterminé par la méthode de coloration au bleu de méthylène. Cette méthode repose sur un colorant, le bleu de méthylène, qui se fixe aux composants cellulaires et les colore en bleu. Ce colorant réagit différemment selon qu’il s’agit de cellules viables ou non viables, car il est transformé par les cellules vivantes (qui restent incolores) tandis que les cellules mortes restent colorées en bleu. Les cellules colorées ont été placées sur un hémocytomètre (également appelé chambre de comptage cellulaire ou chambre de Malassez) et observées au microscope (grossissement x40). L’hémocytomètre est composé de neuf carrés de 1 x 1 mm (1 mm²). Un volume de 1 µL a été utilisé pour chaque mesure.
La turbidité des solutions a été déterminée à l’aide du TURBIDI.T™. L’appareil a été étalonné à l’aide d’étalons de formazine (1 à 4 000 FTU). L’émission et la réception de la lumière ont été assurées respectivement à l’aide de cartouches Emitt.805 (850 nm) et de cartouches Receiv.ViS (longueur d’onde comprise entre 400 nm et 1 000 nm). Une longueur d’onde de 850 nm a été utilisée, car l’effet d’absorption de la lumière par l’échantillon était moindre (données non présentées). Dans le cadre de ces travaux, nous avons choisi d’utiliser des flacons de 10 ml dans lesquels les échantillons ont été aliquotés, puis mesurés sur le TURBIDI.T™. Les données ont été collectées et affichées sur la tablette sur laquelle était installée l’application Soft Matter Analytics App™.
Le comptage cellulaire et les mesures de turbidité ont été effectués en trois exemplaires (n = 3). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type. La variabilité est définie comme le rapport entre l’écart-type et la valeur moyenne.
ANALYSE COMPARATIVE ET CORRÉLATION ENTRE LES INDICATEURS DE TURBIDITÉ ET DE COMPTAGE CELLULAIRE
Résultats et discussion
Des aliquotes cellulaires prélevées au cours de la phase de croissance de la culture de levure ont été analysées par mesure de la turbidité et par comptage cellulaire à l’aide d’une chambre de comptage. La figure 3 présente l’évolution dans le temps de ces deux paramètres, qui augmentent au fil du temps. Le graphique montre que l’évolution de la turbidité et de la concentration cellulaire suit la même tendance, qui est globalement exponentielle. L’augmentation de la concentration cellulaire influe directement sur la turbidité de la culture. Un plus grand nombre de cellules diffuse la lumière et contribue à la turbidité globale du milieu.
Les mesures de turbidité se sont révélées plus cohérentes (avec une variabilité de 3,8 %) par rapport à la technique de comptage cellulaire (dont la variabilité s’élevait à 17,6 %). Cet écart peut s’expliquer par des imprécisions de comptage liées à la perception humaine, mais aussi par la différence de volume d’échantillon entre les deux méthodes. Alors que le comptage cellulaire utilise 1 µL d’échantillon, l’évaluation de la turbidité est réalisée dans cette étude à partir d’aliquotes de 10 mL. En particulier dans les cas impliquant des volumes de bioréacteurs plus importants (comme dans notre étude, 2 L), un volume d’échantillon substantiel contribue à une représentation plus complète des processus en cours au sein de la culture cellulaire, fournissant ainsi une estimation plus précise.
Figure 3: Évolution dans le temps, au cours d’une culture de S. cerevisiae, de (A) la turbidité (FTU) et de (B) la concentration cellulaire (cellules/mL), mesurées à l’aide d’une chambre de comptage cellulaire.
La figure 4 illustre la corrélation linéaire entre les mesures de turbidité et le comptage des cellules au microscope. La courbe est représentée par l’équation suivante : y = 32 345x – 4 894 248 et présente un coefficient de détermination R² = 0,998.
Figure 4 : Corrélation entre le nombre de cellules comptées à l’aide d’une chambre de comptage et la turbidité mesurée à l’aide de TURBIDI.T™
Il est intéressant de noter que des graphiques similaires peuvent être créés à l’aide de différents milieux de culture et types de cellules microbiennes afin de mettre en évidence cette corrélation. Le graphique ainsi obtenu peut ensuite servir à estimer le nombre de cellules présentes dans un échantillon, en établissant simplement une corrélation entre la valeur de turbidité mesurée avec le TURBIDI.T™ et le nombre de cellules correspondant. Cette méthode d’inférence comprend quatre étapes successives (figure 5) :
- Un échantillon dont la concentration en cellules est inconnue est réparti en aliquotes dans un ou plusieurs flacons.
- Le flacon est placé dans la chambre du TURBIDI.T™, puis une mesure est effectuée. Les résultats s’affichent dans l’application Soft Matter Analytics™.
- Grâce à la courbe de corrélation (cellules/mL en fonction des FTU), les FTU sont associées à une densité cellulaire.
- La concentration cellulaire est calculée à l’aide de l’équation de la courbe.
Figure 5 : Une méthode permettant d’estimer la concentration cellulaire dans un milieu de culture liquide présentant une turbidité.
Conclusions et perspectives
- La turbidité des cellules de levure dans un milieu de culture liquide peut être facilement mesurée à l’aide de l’appareil TURBIDI.T™, très simple d’utilisation.
- L’utilisateur peut choisir différentes longueurs d’onde d’émission lumineuse sur le TURBIDI.T™ afin de s’adapter au mieux au type et à la taille des particules ou des cellules. Dans le cas de solutions colorées, la longueur d’onde de 850 nm s’est avérée être la plus précise, car l’absorbance de l’échantillon n’affecte pas les résultats.
- L’analyse du comptage cellulaire réalisée à l’aide d’une chambre de comptage classique présente une forte corrélation avec les valeurs de turbidité (R² = 0,998), ce qui démontre qu’une méthode d’estimation du nombre de cellules dans un milieu de culture peut être facilement mise au point et utilisée efficacement.
- Les fonctionnalités d’acquisition rapide de TURBIDI.T™, associées à l’application Soft Matter Analytics™ très intuitive, permettent de quantifier rapidement les cellules à l’aide de la turbidité et, au final, de gagner du temps et d’économiser des ressources au laboratoire lorsque des mesures de comptage cellulaire de routine sont nécessaires.
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Références
Articles connexes
La détermination de la taille des particules revêt une grande importance dans de nombreux domaines, tels que les sciences de la vie (nanomédecine, administration de médicaments, ingénierie tissulaire, bioanalyse), la chimie, les sciences de l'environnement et l'industrie. La turbidimétrie est une méthode rapide et non destructive permettant d'estimer la taille des particules selon une procédure simple à suivre.