Anwendungshinweis | TURBIDI.T™
Zellkonzentration durch Trübung messen?
von Gloria Pinilla und Nora Kasaplar,
Anwendung Wissenschaftler, Rheolution Inc.
In Zusammenarbeit mit
École Nationale Supérieure de Technologie des Biomolécules de Bordeaux (ENSTBB).
Zusammenfassung
- Die steigende Nachfrage nach schnelleren Methoden zur Zellquantifizierung geht über herkömmliche Zellzählkammern hinaus und erfordert innovative Lösungen, die eine genaue Zählung ermöglichen und gleichzeitig den Zeitaufwand verringern.
- Die Trübung, die die Trübung einer Lösung durch Lichtstreuungspartikel widerspiegelt, erweist sich als wirksames Mittel zur Beschleunigung der Zellquantifizierung.
- In diesem Anwendungshinweis wurde eine starke Korrelation zwischen der Trübung (FTU) einer S. cerevisiae-Kulturlösung und der mit einer herkömmlichen Zellzählkammer ermittelten Zellzahl (Zellen/ml) festgestellt.
- Der Einsatz von TURBIDI.T™ für präzise Trübungsmessungen bietet eine benutzerfreundliche und schnelle Methode zur Schätzung der Zellzahlen und spart somit Zeit und Ressourcen bei der routinemäßigen Zellzählung.
UNTERSUCHUNG VON ALTERNATIVEN ZUR ZELLZÄHLUNG MITTELS TRÜBUNGSMESSUNG
Einleitung
Im Zusammenhang mit der Analyse von Zellkulturen hat der Bedarf an effizienten Methoden zur Zellquantifizierung dazu geführt, dass nach Alternativen zur zeitaufwändigen herkömmlichen Technik der Zellzählkammern gesucht wird. Dieser konventionelle Ansatz ist zwar zuverlässig, stellt jedoch hinsichtlich Geschwindigkeit und Praktikabilität eine Herausforderung dar, insbesondere angesichts wachsender Anforderungen in Forschung und Industrie.
Die Trübung, ein Maß für die Trübheit einer Lösung, erweist sich als interessanter Ansatz zur Beschleunigung der Zellquantifizierung. Der Trübungsgrad in einem Medium steht in Zusammenhang mit der Zellkonzentration innerhalb einer Zellkultur [1]. Unter Ausnutzung dieses Zusammenhangs stellt dieser Anwendungshinweis einen neuen Ansatz zur schnellen Bestimmung der Zellzahlen vor. Diese Methode nutzt die Funktionen von TURBIDI.T™, einem IoT-fähigen Gerät, das für die präzise Trübungsmessung entwickelt wurde. Mit diesem Tool stellen wir eine praktische und effiziente Methode zur Schätzung der Zellzahlen auf der Grundlage von Trübungsmessungen vor, die einen bedeutenden Fortschritt bei den Methoden zur Zellquantifizierung darstellt.
Abbildung 1: Zusammenhang zwischen Trübung und Zellkonzentration. Niedrige Zellkonzentrationen führen zu einer hohen Lichtdurchlässigkeit der Probe, was als geringe Trübung erfasst wird (links), während eine hohe Zellkonzentration zu einer geringeren Lichtdurchlässigkeit führt, was als hohe Trübungswerte in der Probe erfasst wird. Die blauen Pfeile zeigen die Richtung des Lichts an.
METHODIK ZUR ZELLZÄHLUNG MITTELS TRÜBUNGSMESSUNG UND FÄRBEVERFAHREN
Materialien und Methoden
Saccharomyces cerevisiae-Zellen (5–10 µm) wurden in einem Bioreaktor (BIOSTAT B; Sartorius Stedim Biotech, Göttingen, Deutschland) kultiviert, wie in unserem früheren Anwendungshinweis beschrieben (Abbildung 2).
Abbildung 2: Bioreaktoraufbau für die Hefezüchtung unter sterilen Bedingungen.
Die Hefe wurde aus einer zuvor über Nacht gezüchteten Hefe-Vorkultur in den Bioreaktor inokuliert. Es wurde ein Volumen von 100 ml inokuliert, um einen anfänglichen Trübungswert von 200 FTU zu erreichen. Nach der Beimpfung wurden alle zwei Stunden sterile Aliquots entnommen und die Zellzahl (d. h. die Zellkonzentration) mittels der Methylenblau-Färbemethode bestimmt. Diese Methode basiert auf einem Farbstoff, dem Methylenblau, das sich an Zellbestandteile bindet und diese blau färbt. Dieser Farbstoff reagiert in lebensfähigen und nicht lebensfähigen Zellen unterschiedlich, da er von lebenden Zellen umgewandelt wird (wobei er farblos bleibt), während tote Zellen weiterhin blau gefärbt bleiben. Die gefärbten Zellen wurden auf ein Hämozytometer (auch bekannt als Zellzählkammer oder Malassez-Kammer) aufgebracht und unter einem Mikroskop (40-fache Vergrößerung) beobachtet. Das Hämozytometer besteht aus neun Quadraten mit einer Größe von 1 × 1 mm (1 mm²). Für jede Messung wurde ein Volumen von 1 µl verwendet.
Die Trübung der Lösungen wurde mit Hilfe von TURBIDI.T™ bestimmt . Das Gerät wurde mit Formazin-Standards (1–4000 FTU) kalibriert. Die Lichtemission und der Lichtempfang erfolgten unter Verwendung von Emitt.805-Kartuschen (850 nm) bzw. Receiv.ViS-Kartuschen (Wellenlängenbereich von 400 nm bis 1000 nm). Es wurde eine Wellenlänge von 850 nm verwendet, da die Lichtabsorption durch die Probe geringer war (Daten nicht gezeigt). In dieser Arbeit entschieden wir uns für die Verwendung von 10-ml-Fläschchen, in die die Proben aliquotiert und anschließend auf dem TURBIDI.T™ gemessen wurden . Die Daten wurden erfasst und auf dem Tablet angezeigt, auf dem die Soft Matter Analytics App™ ausgeführt wurde.
Sowohl die Zellzählung als auch die Trübungsmessungen wurden dreimal wiederholt (n = 3). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Die Variabilität ist definiert als das Verhältnis zwischen Standardabweichung und Mittelwert.
VERGLEICHENDE ANALYSE UND KORRELATION VON TRÜBUNGS- UND ZELLZAHLUNGSMETRIKEN
Ergebnisse und Diskussion
Zellaliquots in der Wachstumsphase der Hefekultur wurden mittels Trübungsmessung und Zellzählung mit einer Zellzählkammer analysiert. Abbildung 3 zeigt den zeitlichen Verlauf beider Parameter, die im Laufe der Zeit zunehmen. Aus der Grafik geht hervor, dass die Entwicklung der Trübung und der Zellkonzentration demselben Trend folgt, der insgesamt exponentiell verläuft. Der Anstieg der Zellkonzentration wirkt sich direkt auf die Trübung der Kultur aus. Mehr Zellen streuen das Licht und beeinflussen die Gesamtrübung des Mediums.
Die Trübungsmessungen wiesen im Vergleich zur Zellzählmethode (mit einer Variabilität von 17,6 %) eine höhere Konsistenz auf (mit einer Variabilität von 3,8 %). Diese Abweichung lässt sich auf Ungenauigkeiten bei der Zählung aufgrund menschlicher Wahrnehmung zurückführen, aber auch auf die unterschiedlichen Probenvolumina bei den beiden Methoden. Während bei der Zellzählung 1 µl Probe verwendet wird, erfolgt die Trübungsmessung in dieser Studie anhand von 10-ml-Aliquots. Insbesondere bei größeren Bioreaktorvolumina (wie in unserem Fall 2 l) trägt ein beträchtliches Probenvolumen zu einer umfassenderen Darstellung der ablaufenden Prozesse innerhalb der Zellkultur bei und liefert folglich eine genauere Schätzung.
Abbildung 3: Zeitlicher Verlauf in einer S. cerevisiae- Kultur von (A) der Trübung (FTU) und (B) der Zellkonzentration (Zellen/ml), gemessen mit einer Zellzählkammer.
Abbildung 4 veranschaulicht die lineare Korrelation zwischen den Trübungsmessungen und der mikroskopischen Zellzählung. Die Kurve wird durch die folgende Gleichung beschrieben: y = 32.345x – 4.894.248 und weist einen Bestimmungskoeffizienten R² = 0,998 auf .
Abbildung 4: Korrelation zwischen der mit einer Zellzählkammer ermittelten Zellzahl und der Trübung unter Verwendung von TURBIDI.T™
Es ist interessant festzustellen, dass sich ähnliche Diagramme unter Verwendung unterschiedlicher Nährmedien und mikrobieller Zelltypen erstellen lassen, um diesen Zusammenhang darzustellen. Das so erhaltene Diagramm kann anschließend dazu verwendet werden, die Zellzahl in einer Probe zu schätzen, indem der mit TURBIDI.T™ gemessene Trübungswert einfach mit der entsprechenden Zellzahl in Beziehung gesetzt wird. Dieses Ableitungsverfahren umfasst vier aufeinanderfolgende Schritte (Abbildung 5):
- Eine Probe mit einer unbekannten Zellkonzentration wird in (ein) Fläschchen aliquotiert.
- Die Küvette wird in die TURBIDI.T™ -Kammer eingesetzt, und es wird eine Messung durchgeführt. Die Ergebnisse werden über die Soft Matter Analytics™-App angezeigt.
- Anhand der Korrelationskurve (Zellen/ml vs. FTUs) lassen sich die FTUs einer Zelldichte zuordnen.
- Die Zellkonzentration wird anhand der Kurvengleichung berechnet.
Abbildung 5: Ein Verfahren zur Schätzung der Zellkonzentration in trübem flüssigem Kulturmedium.
Schlussfolgerungen und Ausblick
- Die Trübung von Hefezellen in einem flüssigen Kulturmedium lässt sich mit dem benutzerfreundlichen TURBIDI.T™ -Gerät problemlos messen.
- Der Anwender kann beim TURBIDI.T™ zwischen verschiedenen Wellenlängen der Lichtemission wählen, um diese besser an die Art und Größe der Partikel oder Zellen anzupassen. Bei farbigen Lösungen hat sich 850 nm als die präziseste Wellenlänge erwiesen, da die Absorption der Probe die Ergebnisse nicht beeinflusst.
- Die Analyse der Zellzahl mittels einer herkömmlichen Zellzählkammer weist eine hohe Korrelation mit den Trübungswerten auf (R² = 0,998), was zeigt, dass sich ein Verfahren zur Schätzung der Zellzahl in einem Kulturmedium leicht entwickeln und effektiv anwenden lässt.
- Die Funktionen zur schnellen Datenerfassung von TURBIDI.T™ in Kombination mit der benutzerfreundlichen Soft Matter Analytics™-App ermöglichen eine zügige Quantifizierung von Zellen anhand der Trübung und tragen letztendlich dazu bei, Zeit und Ressourcen im Labor zu sparen, wenn routinemäßige Zellzählungen erforderlich sind.
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Literaturverzeichnis
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