Blog Post Image: Methods to Quantify Cell Concentration Using TURBIDI.T™ Technology.

アプリケーションノート | TURBIDI.T™

濁度を用いて細胞濃度を測定する方法とは？

by Gloria Pinilla and Nora Kasaplar,

応用科学者、 Rheolution Inc.

協力：

ボルドー国立生体分子技術高等学院（ENSTBB）。

概要

より迅速な細胞定量法への需要の高まりは、従来の細胞計数板の限界を超え、正確な計数を可能にしつつ時間を短縮する革新的なソリューションの登場を促しています。
光散乱物質の存在下における溶液の濁りを反映する「濁度」は、細胞定量を迅速化する有効な手段として注目されている。
本アプリケーションノートでは、S. cerevisiae培養液の濁度（FTU）と、従来の細胞計数カメラを用いて計数した細胞数（細胞/mL）との間に、強い相関関係が確認された。
TURBIDI.T™を利用して濁度を正確に測定することで、細胞数の推定が簡単かつ迅速に行えるため、日常的な細胞計数にかかる時間とリソースを節約できます。

濁度測定による細胞計数の代替手法の検討

はじめに

細胞培養の分析において、効率的な細胞定量法への需要が高まっていることから、時間がかかりがちな従来の細胞計数板を用いた手法に代わる方法の模索が進められている。この従来の手法は信頼性が高いものの、特に研究や産業分野での要求が高まる中、速度や実用性の面で課題を抱えている。

溶液の濁りを表す指標である「濁度」は、細胞数の定量を迅速化するための興味深い手法として注目されています。培地中の濁度のレベルは、細胞培養中の細胞濃度と関連していることが分かっています[1]。この相関関係を活用し、本アプリケーションノートでは、細胞数を迅速に測定する新しい手法を紹介します。この手法は、正確な濁度測定のために設計されたIoT対応装置「TURBIDI.T™」の機能を活用しています。本ツールを活用することで、濁度測定値に基づいて細胞数を推定するための実用的かつ効率的な手法を提案し、細胞定量手法において大きな前進を遂げた。

図1： 濁度と細胞濃度の関係 。細胞濃度が低いと、試料を通る光の透過率が高くなり、濁度が低く検出される（左）。一方、細胞濃度が高いと光の透過率が低下し、試料の濁度値として高く検出される。青い矢印は光の進行方向を示している。

濁度法および染色法を用いた細胞計数法

材料および方法

Saccharomyces cerevisiae 細胞（5～10 µm）を、以前のアプリケーションノートで説明した方法（図2）に従い、バイオリアクター（BIOSTAT B；Sartorius Stedim Biotech、ドイツ・ゲッティンゲン）内で培養した。

図2： 無菌条件下での酵母培養用のバイオリアクターの構成。

前夜に培養しておいた酵母の予備培養液から、バイオリアクターに酵母を接種した。初期濁度を200 FTUとするため、100 mLを接種した。接種後、2時間ごとに無菌の試料を採取し、メチレンブルー染色法を用いて細胞数（すなわち細胞濃度）を測定した。この方法は、細胞成分に結合して青く染色する染料であるメチレンブルーに基づいている。この色素は、生細胞と死細胞で異なる反応を示す。生細胞では代謝され（無色のままとなる）が、死細胞では青色のまま着色された状態が維持されるからである。着色された細胞を血球計数板（別名：細胞計数板、またはマラセーズチャンバー）に載せ、顕微鏡（40倍）で観察した。血球計数板は、1 × 1 mm（1 mm²）の正方形が9つ並んだ構造になっている。各測定には1 µLの試料を用いた。

溶液の濁度は、TURBIDI.T™を用いて測定した。本装置は、フォルマジン標準液（1～4000 FTU）を用いて校正した。発光および受光は、それぞれEmitt.805カートリッジ（850 nm）およびReceiv.ViSカートリッジ（波長範囲400 nm～1000 nm）を用いて行った。試料による光吸収の影響が小さかったため、波長850 nmを用いた（データ未掲載）。本研究では、10 mLバイアルを使用し、そこに試料を分注してTURBIDI.T™で測定を行った。データは、「Soft Matter Analytics App™」を動作させるタブレット上で収集・表示されました。

細胞数測定および濁度測定はいずれも3回ずつ（n=3）実施した。データは平均値±標準偏差として示されている。変動性は、標準偏差と平均値の比率として定義される。

濁度と細胞計数指標の比較分析および相関関係

結果と考察

酵母培養の増殖期における細胞の分注液について、濁度測定および細胞計数板を用いた細胞数測定を行った。図3は、これらのパラメータの経時変化を示しており、いずれも時間の経過とともに増加している。グラフから、濁度と細胞濃度の変化は同じ傾向を示しており、全体として指数関数的な増加が見られることがわかる。細胞濃度の増加は、培養液の濁度に直接影響を与えている。細胞の数が増えるほど、より多くの細胞が光を散乱させ、培地全体の濁度に影響を及ぼしている。

濁度測定は、細胞計数法（変動率17.6％）と比較して、より一貫性が高かった（変動率3.8％）。この差異は、人間の知覚による計数の不正確さだけでなく、2つの手法間のサンプル体積の違いにも起因していると考えられる。細胞計数では1µLのサンプルを使用するのに対し、本研究では濁度測定に10mLの分注液を使用している。特に、より大きなバイオリアクター容量（本研究の場合、2 L）が関与するシナリオでは、サンプル量が多いほど、細胞培養内で進行中のプロセスをより包括的に把握することができ、その結果、より正確な推定が可能となります。

図3：S. cerevisiaeの培養経過に伴う、（A）濁度（FTU）および（B）細胞計数チャンバーを用いて測定した細胞濃度（細胞/mL）の変化。

図4は、濁度測定値と顕微鏡による細胞数測定との間の線形相関関係を示している。この曲線は、y=32 345x-4 894 248という式で表され、決定係数R²は0.998である。

図4： 細胞計数チャンバーで計数した細胞数と、TURBIDI.T™を用いた濁度との相関関係

興味深いことに、この相関関係を捉えるために、異なる培地や微生物の細胞種を用いて同様のグラフを作成することができる。得られたグラフを用いれば、TURBIDI.T™で測定された濁度値とそれに対応する細胞数を単純に相関させるだけで、試料中の細胞数を推定することができる。この推論手法は、4つの連続したステップから構成されています（図5）：

未知の濃度の細胞を含む試料を、(a) 本のバイアルに分注する。
バイアルをTURBIDI.T™チャンバーにセットし、測定を行います。測定結果はSoft Matter Analytics™アプリに表示されます。
相関曲線（細胞数/mL 対 FTU）を用いることで、FTU は細胞密度と関連付けられます。
細胞濃度は、曲線方程式を用いて算出されます。

図5： 濁度を伴う液体培養液中の細胞濃度を推定する方法。

結論と展望

液体培養液中の酵母細胞の濁度は、操作が簡単なTURBIDI.T™装置を用いて簡単に測定できます。
TURBIDI.T™では、粒子や細胞の種類や大きさに合わせて、発光波長を選択することができます。着色溶液の場合、サンプルの吸光度が測定結果に影響を与えないため、850 nmが最も精度の高い波長であることが分かっています。
従来の細胞計数チャンバーを用いた細胞数測定結果は、濁度値と極めて高い相関関係（R²=0.998）を示しており、培養液中の細胞数を推定するための推論手法を容易に開発し、効果的に活用できることが実証された。
TURBIDI.T™の高速測定機能と、使いやすいSoft Matter Analytics™アプリを組み合わせることで、濁度を用いて細胞を迅速に定量化することができ、日常的な細胞計数測定が必要な際に、実験室での時間とリソースの節約につながります。