Anwendungshinweis | TURBIDI.T™
Verbesserung der Überwachung des Hefewachstums durch Trübungsmessung
von Gloria Pinilla und Nora Kasaplar,
Anwendung Wissenschaftler, Rheolution Inc.
In Zusammenarbeit mit
École Nationale Supérieure de Technologie des Biomolécules de Bordeaux (ENSTBB).
Zusammenfassung
- Die Überwachung des Hefewachstums ist ein entscheidender Prozess, um optimale Bedingungen und Produktivität in biotechnologischen Verfahren zu gewährleisten.
- Messungen auf Basis der Trübung haben sich als schnelles, zerstörungsfreies Verfahren zur Abschätzung des Hefewachstums und zur Verfolgung der Kulturdichte im Zeitverlauf etabliert. TURBIDI.T™ (Rheolution, QC, Kanada) wurde eingesetzt, um das Wachstum von S. cerevisiae im Zeitverlauf präzise zu überwachen.
- Die Ergebnisse zur Trübung (850 nm) und zur Extinktion (600 nm) wurden miteinander verglichen und zeigen ähnliche Trends sowie eine starke Korrelation.
- TURBIDI.T™ hat gegenüber Spektrophotometern zahlreiche Vorteile bei der Analyse des Zellwachstums und der Datenerfassung aufgezeigt.
Fortschritte bei der Überwachung des Hefewachstums: Trübungsmessung
Einleitung
Im Bereich der Bioingenieurwissenschaften und der Biotechnologie dienen Zellen als Katalysatoren für die Herstellung vielfältiger wertvoller Produkte, wie beispielsweise Biokraftstoffe, Arzneimittel, Antikörper, industrielle Enzyme und biobasierte Chemikalien [1]. In diesem Zusammenhang spielt die Hefe, ein weit verbreiteter Mikroorganismus, eine zentrale Rolle. Die Überwachung des Hefewachstums ist von größter Bedeutung, um optimale Bedingungen und Produktivität in biotechnologischen Prozessen zu gewährleisten [2].
Traditionell wird die spektrophotometrische Analyse eingesetzt, um die optische Dichte bei 600 nm (OD600 nm) durch Messung der Lichtabsorption durch die Hefekultur zu bestimmen und die Entwicklung der Trübung einer Zellpopulation zu überwachen. Trübungsbasierte Messungen haben sich als schneller, zerstörungsfreier Ansatz zur Abschätzung des Hefewachstums und zur Verfolgung der Kulturdichte im Zeitverlauf etabliert. Diese Methodik nutzt die Prinzipien der Lichtstreuung, bei der Veränderungen der Zellkonzentration und -größe die Intensität des von der Kultur gestreuten Lichts beeinflussen. Durch die Quantifizierung der daraus resultierenden Trübung lassen sich wertvolle Erkenntnisse über den Verlauf des Zellwachstums gewinnen.
Saccharomyces cerevisiae (5–10 µm), auch bekannt als Backhefe oder Bierhefe, nimmt als Modellorganismus im Bereich der industriellen Produktion eine herausragende Stellung ein. Dies ist auf seine gut charakterisierten Eigenschaften, seine Robustheit, seine hohe Produktivität und seine Vielseitigkeit zurückzuführen.
Dieser Anwendungshinweis befasst sich mit dem Einsatz von TURBIDI.T™ (Rheolution, QC, Kanada) zur Überwachung des Wachstums von S. cerevisiae im Zeitverlauf. Die erzielten Ergebnisse werden mit den mittels eines Standard-Spektralphotometers erfassten OD600nm-Messwerten verglichen und in Beziehung gesetzt. Durch die Auswertung dieses Vergleichs lassen sich wertvolle Erkenntnisse gewinnen, um die Wirksamkeit und Zuverlässigkeit von TURBIDI.T™ als Instrument zur Überwachung des Hefewachstums besser zu verstehen.
Überwachung des Hefewachstums mittels Trübungsmessung: Eine Fallstudie zu S. cerevisiae
Materialien und Methoden
Unter sterilen Bedingungen wurde eine Hefe-Vorkultur von 100 ml hergestellt, indem S. cerevisiae-Kolonien aus einer Festkultur auf einer Petrischale beimpft und anschließend über Nacht gewachsen wurden. Gleichzeitig wurde ein 3-Liter-Bioreaktor (BIOSTAT B; Sartorius Stedim Biotech, Göttingen, Deutschland), der steriles synthetisches Nährmedium [3] enthielt, für die nächtliche Sterilisation im Autoklav vorbereitet. Das synthetische Nährmedium bestand aus verschiedenen anorganischen Salzen ((NH₄)₂SO₄, KH₂PO₄, MgSO₄), Vitaminen, Spurenelementen und Glukose. Nach der Sterilisation wurden die pH- und pO₂-Sonden sowie die Glukosezufuhrpumpe gemäß den Anweisungen der BIOSTAT B-Software kalibriert (Abbildung 1).
Abbildung 1: Aufbau eines Bioreaktors für die Hefekultur unter sterilen Bedingungen.
Zur Kalibrierung des TURBIDI.T™ wurden vor der Prüfung Formazin-Standardlösungen verwendet. Die Lichtemission und der Lichtempfang wurden mithilfe von Emitt.805-Kartuschen (Wellenlänge 850 nm) bzw. Receiv.ViS-Kartuschen (Wellenlängenbereich von 400 nm bis 1000 nm) ermöglicht. Wir entschieden uns für die Verwendung der 850-nm-Kartusche, da der Einfluss der Lichtabsorption geringer war. Das Spektralphotometer (SAFAS UVmc, SAFAS, Monaco) wurde vor jeder Messung mit einem Fläschchen entionisiertem destilliertem Wasser (ddH₂O) kalibriert.
Die vorkultivierten Hefen wurden in einer Dichte von 220 FTU (0,21 uOD) in den Bioreaktor eingesaat. Anschließend wurde das Hefewachstum überwacht, indem über einen Zeitraum von 8 Stunden stündlich Hefealiquots entnommen wurden. Die Messungen der Trübung bei 850 nm (ausgedrückt in FTU) und der Extinktion (ausgedrückt in uOD) wurden für jeden Zeitpunkt dreifach durchgeführt (n = 3). Für die spektrophotometrischen Messungen wurde die Hefekultur-Probe im Verhältnis 1:100 verdünnt, während für die turbidimetrischen Messungen keine Verdünnung erforderlich war und die Proben direkt untersucht wurden. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt.
Analyse der Wachstumsdynamik von Hefe: Messungen der Trübung im Vergleich zur Extinktion in S. cerevisiae-Kulturen
Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 2 veranschaulicht das Wachstumsverhalten von Hefe im Zeitverlauf und zeigt nach einer kurzen Latenzphase von 2 Stunden einen deutlichen exponentiellen Anstieg sowohl in Trübungseinheiten (FTU) als auch in Absorptionswerten (uOD). Während der Latenzphase durchlaufen die Hefezellen eine Anpassungsphase, in der sie sich schrittweise an ihre Umgebung anpassen. Nach Abschluss dieser Phase steigt die Kurve steil an und verdeutlicht die kontinuierliche Vermehrung der Hefezellen. Diese exponentielle Wachstumsphase weist auf das Vorliegen optimaler Bedingungen für das Hefewachstum hin, bei denen Faktoren wie die Verfügbarkeit von Nährstoffen und Umweltsignale eine aktive Zellteilung und Stoffwechselaktivität fördern.
Abbildung 2: Aufbau eines Bioreaktors für die Hefezucht unter sterilen Bedingungen. Entwicklung der Trübung von S. cerevisiae Kultur über 8 Stunden und Vergleich zwischen der Trübung bei 850 nm und der optischen Dichte600 nm.
Die mit TURBIDI.T™ ermittelten Trübungsmesswerte (auf der linken Y-Achse dargestellt) stimmen weitgehend mit den mit einem Standard-Spektralphotometer ermittelten Absorptionswerten (auf der rechten Y-Achse dargestellt) überein, da beide Kurven einen ähnlichen Verlauf aufweisen. Die Standardabweichungen waren durchweg sehr gering (Fehlerbalken sind in der Grafik enthalten), was die hohe Präzision der Messungen belegt (Variabilität unter 1 %).
In Übereinstimmung mit den Beobachtungen aus Abbildung 2 besteht eine positive lineare Korrelation zwischen den Trübungs- und den OD600nm-Messwerten, mit einem beeindruckenden Bestimmtheitsmaß (R²) von 0,998 (Abbildung 3). Dieser hohe R²-Wert deutet auf einen starken und zuverlässigen Zusammenhang zwischen Trübung und OD600nm hin und legt nahe, dass Trübungsmessungen bei der Überwachung des Hefewachstums effektiv als Ersatz für absorbanzbasierte Messungen dienen können.
Abbildung 3: Korrelation zwischen FTU (850 nm) und uOD (600 nm) bei der Messung des Zellkulturwachstums.
Die enge Übereinstimmung zwischen den Trübungs- und Absorptionsmessungen sowie der hohe Korrelationskoeffizient unterstreichen die Wirksamkeit und Genauigkeit der auf der Trübungsmessung basierenden Messungen mit TURBIDI.T™ zur Überwachung der Wachstumsdynamik von Hefen.
Darüber hinaus unterstreicht die Möglichkeit, zuverlässige Wachstumsdaten zu erhalten, ohne dass eine Probenverdünnung erforderlich ist – wie dies bei der herkömmlichen spektrophotometrischen Analyse der Fall ist –, die Vorteile des auf Trübung basierenden Ansatzes noch weiter. Insgesamt belegen diese Ergebnisse das Potenzial von TURBIDI.T™ als wertvolles Instrument zur präzisen und effizienten Überwachung des Hefewachstums in biotechnologischen Prozessen, was zu Fortschritten in der biotechnologischen Forschung und in der praktischen Anwendung beiträgt.
Schlussfolgerungen und Ausblick
- Das TURBIDI.T™ -System erwies sich als leistungsstarkes und präzises Instrument zur Überwachung des Zellwachstums und der Kinetik in Hefekulturen.
- Der Vergleich zwischen Trübung und OD600 nm zeigt eine starke lineare Beziehung, wodurch sich die Trübung als präzise Alternative zu absorbanzbasierten Messungen etabliert. Dies unterstreicht die Eignung der Trübung zur genauen Beurteilung der Wachstumsdynamik von Hefe.
- TURBIDI.T™ bietet gegenüber der spektrophotometrischen Analyse mehrere Vorteile. Da dank des großen Messbereichs des TURBIDI.T™ -Geräts keine Probenverdünnung erforderlich ist, werden Messfehler reduziert und wertvolle Zeit gespart. Darüber hinaus ermöglicht das tragbare Tablet eine einfache Datenerfassung und -speicherung, was den Komfort und die Zugänglichkeit erhöht.
- Dank der Vielseitigkeit des TURBIDI.T™ -Systems können verschiedene Küvetten für Messungen in unterschiedlichen Versuchsaufbauten verwendet werden.
- Die Skalierbarkeit des TURBIDI.T™-Systems steigert dessen Nutzen zusätzlich. Durch den Anschluss mehrerer Geräte an ein einziges Bedien-Tablet wird die Testleistung verbessert, sodass bei groß angelegten Experimenten gleichzeitige Messungen möglich sind.
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Literaturverzeichnis
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