Nota de aplicación | TURBIDI.T™
Avances en el seguimiento del crecimiento de la levadura mediante la medición de la turbidez
por Gloria Pinilla y Nora Kasaplar,
Aplicación Científicos, Rheolution Inc.
En colaboración con
Escuela Nacional Superior de Tecnología de Biomoléculas de Burdeos (ENSTBB).
Resumen
- El seguimiento del crecimiento de la levadura es un proceso clave para garantizar unas condiciones óptimas y la productividad en los procesos biotecnológicos.
- Las mediciones basadas en la turbidez se han convertido en un método rápido y no destructivo para estimar el crecimiento de la levadura y hacer un seguimiento de la densidad del cultivo a lo largo del tiempo. Se ha utilizado TURBIDI.T™ (Rheolution, QC, Canadá) para supervisar con precisión el crecimiento de S. cerevisiae a lo largo del tiempo.
- Se han comparado los resultados de turbidez (850 nm) y absorbancia (600 nm), lo que ha puesto de manifiesto tendencias similares y una fuerte correlación.
- TURBIDI.T™ ha demostrado tener múltiples ventajas frente al espectrofotómetro en lo que respecta al análisis del crecimiento celular y la recopilación de datos.
Avances en el seguimiento del crecimiento de la levadura: medición de la turbidez
Introducción
En el ámbito de la bioingeniería y la biotecnología, las células actúan como catalizadores para la producción de diversos productos valiosos, como biocombustibles, fármacos, anticuerpos, enzimas industriales y productos químicos de origen biológico [1]. En este contexto, la levadura, un microorganismo muy utilizado, desempeña un papel fundamental. Controlar el crecimiento de la levadura es de vital importancia para garantizar unas condiciones óptimas y la productividad en los procesos biotecnológicos [2].
Tradicionalmente, el análisis espectrofotométrico se ha utilizado para evaluar la densidad óptica a 600 nm (DO600nm) midiendo la absorción de luz por parte del cultivo de levadura, y para seguir la evolución de la turbidez de una población celular. Las mediciones basadas en la turbidez se han convertido en un método rápido y no destructivo para estimar el crecimiento de la levadura y seguir la densidad del cultivo a lo largo del tiempo. Esta metodología se basa en los principios de la dispersión de la luz, según los cuales los cambios en la concentración y el tamaño de las células influyen en la intensidad de la luz dispersada por el cultivo. Al cuantificar la turbidez resultante, se puede obtener información valiosa sobre la progresión del crecimiento celular.
La Saccharomyces cerevisiae (5-10 µm), también conocida como levadura de panadería o levadura de cerveza, ocupa un lugar destacado como organismo modelo en el ámbito de la producción industrial. Esto se debe a que está muy bien caracterizada, es resistente, tiene una alta productividad y es muy versátil.
Esta nota de aplicación se centra en el uso de TURBIDI.T™ (Rheolution, QC, Canadá) para monitorizar el crecimiento de S. cerevisiae a lo largo del tiempo. Los resultados obtenidos se comparan y se correlacionan con las mediciones de DO600 nm realizadas con un espectrofotómetro estándar. Al analizar esta comparación, se pueden obtener datos valiosos para comprender mejor la eficacia y la fiabilidad de TURBIDI.T™ como herramienta de seguimiento del crecimiento de la levadura.
Seguimiento del crecimiento de la levadura mediante la medición de la turbidez: un estudio de caso sobre S. cerevisiae
Materiales y métodos
Se preparó un precultivo de levadura de 100 ml en condiciones estériles inoculando colonias de S. cerevisiae procedentes de un cultivo sólido en una placa de Petri, y se dejó crecer durante toda la noche. Al mismo tiempo, se preparó un biorreactor de 3 l (BIOSTAT B; Sartorius Stedim Biotech, Gotinga, Alemania) que contenía medio de cultivo sintético estéril [3] se preparó para esterilizarlo durante toda la noche en un autoclave. El medio de cultivo sintético estaba compuesto por diversas sales inorgánicas ((NH₄)₂SO₄, KH₂PO₄, MgSO₄), vitaminas, oligoelementos y glucosa. Tras la esterilización, se calibraron las sondas de pH y pO₂, así como la bomba de alimentación de glucosa, siguiendo las instrucciones del software del BIOSTAT B (Figura 1).
Figura 1: Configuración del biorreactor para el cultivo de levadura en condiciones estériles.
Para calibrar el TURBIDI.T™, se utilizaron patrones de formazina antes de realizar las pruebas. La emisión y la recepción de luz se activaron utilizando cartuchos Emitt.805 (longitud de onda de 850 nm) y cartuchos Receiv.ViS (longitud de onda comprendida entre 400 nm y 1000 nm), respectivamente. Decidimos usar el cartucho de 850 nm porque el efecto de la absorción de luz era menor. El espectrofotómetro (SAFAS UVmc, SAFAS, Mónaco) se calibró con un vial de agua destilada desionizada (ddH₂O) antes de cada medición.
Las levaduras precultivadas se sembraron en el biorreactor a una densidad de 220 FTU (0,21 uOD). Después, se controló el crecimiento de la levadura tomando alícuotas cada hora durante 8 horas. Las mediciones de turbidez a 850 nm (expresadas en FTU) y de absorbancia (expresadas en uOD) se realizaron por triplicado para cada punto temporal (n = 3). Para las mediciones espectrofotométricas, la muestra del cultivo de levadura se diluyó en una proporción de 1:100, mientras que para las mediciones turbidimétricas no se necesitó dilución alguna y las muestras se analizaron directamente. Los resultados se presentan como media ± desviación estándar.
Análisis de la dinámica de crecimiento de la levadura: mediciones de turbidez frente a mediciones de absorbancia en cultivos de S. cerevisiae
Resultados y discusión
La figura 2 muestra el patrón de crecimiento de la levadura a lo largo del tiempo, con un notable aumento exponencial tanto en unidades de turbidez (FTU) como en unidades de absorbancia (uOD) tras un breve periodo de latencia de 2 horas. Durante la fase de latencia, las células de levadura pasan por un periodo de adaptación, ajustándose poco a poco a su entorno. Al finalizar esta fase, la curva se dispara, lo que demuestra la proliferación continua de las células de levadura. Esta fase de crecimiento exponencial indica que hay condiciones óptimas para el crecimiento de la levadura, en las que factores como la disponibilidad de nutrientes y las señales ambientales favorecen la división celular activa y la actividad metabólica.
Figura 2: Montaje de un biorreactor para el cultivo de levadura en condiciones estériles. Evolución de la turbidez de S. cerevisiae cultivo durante 8 h y comparación entre la turbidez a 850 nm y la DO600 nm.
Las mediciones de turbidez obtenidas con TURBIDI.T™ (representadas en el eje Y de la izquierda) coinciden prácticamente con los valores de absorbancia obtenidos con un espectrofotómetro estándar (que se muestran en el eje Y de la derecha), ya que ambas curvas siguen una tendencia similar. Las desviaciones estándar fueron todas muy bajas (las barras de error aparecen en el gráfico), lo que demuestra la alta precisión de las mediciones (variabilidad inferior al 1 %).
En consonancia con lo que se ve en la figura 2, hay una correlación lineal positiva entre la turbidez y las mediciones de OD600 nm, con un impresionante coeficiente de determinación (R²) de 0,998 (figura 3). Este elevado valor de R² indica una relación sólida y fiable entre la turbidez y la DO600 nm, lo que sugiere que las mediciones de turbidez pueden servir eficazmente como sustituto de las mediciones basadas en la absorbancia a la hora de controlar el crecimiento de la levadura.
Figura 3: Correlación entre la FTU (850 nm) y la uOD (600 nm) en la medición del crecimiento de cultivos celulares.
La estrecha correspondencia entre las mediciones de turbidez y de absorbancia, junto con el elevado coeficiente de correlación, pone de manifiesto la eficacia y la precisión de las mediciones basadas en la turbidez realizadas con TURBIDI.T™ para seguir la evolución del crecimiento de la levadura.
Además, la posibilidad de obtener datos fiables sobre el crecimiento sin necesidad de diluir las muestras, como ocurre en los análisis espectrofotométricos tradicionales, pone aún más de relieve las ventajas que ofrece el método basado en la turbidez. En general, estos resultados demuestran el potencial de TURBIDI.T™ como una herramienta valiosa para el seguimiento preciso y eficiente del crecimiento de la levadura en los bioprocesos, lo que contribuye a los avances en la investigación y las aplicaciones biotecnológicas.
Conclusiones y perspectivas
- El sistema TURBIDI.T™ ha demostrado ser una herramienta potente y precisa para controlar el crecimiento y la cinética de los cultivos celulares en cultivos de levadura.
- La comparación entre la turbidez y el valor OD600 nm revela una fuerte relación lineal, lo que convierte a la turbidez en una alternativa precisa a las mediciones basadas en la absorbancia. Esto pone de manifiesto la eficacia de la turbidez a la hora de evaluar con precisión la dinámica de crecimiento de la levadura.
- TURBIDI.T™ ofrece varias ventajas en comparación con el análisis con espectrofotómetro. Al no tener que diluir las muestras, gracias al amplio rango de valores de turbidez que mide el instrumento TURBIDI.T™, se reducen los errores de medición y se ahorra un tiempo muy valioso. Además, la tableta portátil facilita la recogida y el almacenamiento de datos, lo que mejora la comodidad y la accesibilidad.
- La versatilidad del sistema TURBIDI.T™ permite utilizar diferentes viales para realizar mediciones en distintas configuraciones experimentales.
- La escalabilidad del sistema TURBIDI.T™ aumenta aún más su valor. Conectar varias unidades a una sola tableta de control mejora la eficiencia de los ensayos, lo que permite realizar mediciones simultáneas en experimentos a mayor escala.
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Referencias
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