Nota de aplicación | ElastoSens™ Bio
Ajuste de la rigidez de los hidrogeles de ECM con ElastoSens™ Bio
En colaboración con
Nota
Este estudio fue fruto de una colaboración conjunta entre Rheolution (QC, Canadá) y Gelomics (QLD, Australia).
por Gloria Pinilla, M.Sc., especialista sénior en aplicaciones de Rheolution Inc.
Resumen
- La rigidez inicial de los sistemas de cultivo en 3D se puede modificar para estudiar procesos fisiológicos y patológicos in vitro.
- Los hidrogeles fotocrosslinkables son excelentes candidatos para los sistemas de cultivo en 3D, gracias a su similitud con la matriz extracelular natural y a lo fácil que resulta controlar su rigidez final.
- Los productos de matriz extracelular LunaGel™ de Gelomics se reticularon con éxito mediante luz visible y se midió su cinética de reticulación en tiempo real en el ElastoSens™ Bio.
- Las reacciones de reticulación fotoquímica se produjeron rápidamente tanto en los kits LunaGel™ de baja rigidez como en los de alta rigidez.
- Los kits LunaGel™ de alta rigidez dieron como resultado una mayor rigidez que los kits de baja rigidez.
- La rigidez de las matrices de LunaGel™ aumentó a medida que se prolongaba la duración de la reticulación por luz.
- La capacidad invasiva de las células de cáncer de mama aumentó significativamente al aumentar la rigidez de la MEC.
El papel de la rigidez del hidrogel en el comportamiento celular
Introducción
Todas las células del cuerpo humano están expuestas a fuerzas mecánicas que regulan su función y el desarrollo de los tejidos, y cada tipo de célula se adapta específicamente a las propiedades mecánicas del tejido en el que se encuentra. Las propiedades de la matriz de los tejidos humanos también pueden cambiar con la enfermedad y, a su vez, facilitar su progresión. Por ejemplo, el crecimiento, la supervivencia, la diferenciación y la morfogénesis de las células epiteliales mamarias normales se ven favorecidos por la interacción con una matriz blanda, similar a la rigidez del tejido mamario normal. Sin embargo, tras la transformación que se produce en el cáncer de mama, el tejido se vuelve cada vez más rígido [1] y las células tumorales se vuelven significativamente más contráctiles e hiperreactivas a las señales mecánicas de la matriz, lo que, en última instancia, provoca la transición epitelial a mesenquimal (EMT) y la metástasis [2,3]. La investigación de los mecanismos que subyacen a la compleja interacción entre las propiedades del sustrato y el comportamiento celular requiere metodologías avanzadas de cultivo celular que superen las limitaciones asociadas a los enfoques de cultivo tradicionales [4].
Las matrices extracelulares (MEC) LunaGel™ de Gelomics son hidrogeles fotocrosslinkables que ofrecen un sistema de cultivo celular 3D controlado para estudiar procesos patológicos y fisiológicos in vitro. Basadas en componentes de la MEC como el colágeno de tipo I, III, IV y V, así como en glicoproteínas y proteoglicanos del tejido conectivo, estas MEC imitan fielmente la matriz extracelular (MEC) natural que rodea a las células en el cuerpo humano y facilitan la adhesión, proliferación, diferenciación y migración celular, así como la degradación proteolítica de la MEC. Además, el proceso de reticulación fotoinducida permite a los científicos controlar mejor la rigidez final. Con solo variar la duración de la reticulación, se puede ajustar con precisión la rigidez del gel para imitar tejidos blandos y duros, como el cerebro, el hígado, la mama o el cartílago, entre otros, tanto en condiciones sanas como patológicas. Por estas razones, son sustratos ideales para el cultivo y la diferenciación de una amplia gama de tipos celulares y facilitan el estudio de los cambios en el comportamiento celular provocados por la rigidez de la matriz.
ElastoSens™ Bio mide sin contacto las propiedades viscoelásticas de los materiales blandos. Al aplicar ligeras vibraciones a la muestra, el instrumento es capaz de registrar la cinética de reticulación fotoquímica en la longitud de onda deseada. En esta nota de aplicación, se sometieron a fotoreticulación los ECM LunaGel™, basados en piel porcina modificada químicamente y gelatina de hueso bovino, mientras se evaluaba en tiempo real su cinética de reticulación en el ElastoSens™ Bio. Para investigar si las MEC LunaGel™ son adecuadas para imitar los cambios fisiopatológicos en la rigidez de los tejidos y sus efectos en la progresión del cáncer, se cultivaron esferoides de cáncer de mama sobre sustratos de diferente rigidez y se observaron sus morfologías.
Reticulación por luz de los hidrogeles LunaGel™ mediante Gelomics
Materiales y métodos
Los ECM LunaGel™ a base de gelatina de piel porcina modificada químicamente, tipo A (LunaGel™ – Gelatina de piel porcina – baja y alta rigidez, Gelomics) y gelatina de hueso bovino, tipo B (LunaGel™ – Gelatina de hueso bovino – baja y alta rigidez, Gelomics), se prepararon siguiendo las instrucciones del fabricante. En resumen, se disolvieron los viales de fotoiniciador en PBS y se mezclaron con las soluciones de ECM fotocrosslinkables a 37 °C. Se pipetearon 2 ml de los productos en el portamuestras del ElastoSens™ Bio y se inició inmediatamente el ensayo de viscoelasticidad a 37 °C utilizando las siguientes secuencias de medición:
El módulo de elasticidad al cizallamiento (G’) y tan(δ) se obtuvieron directamente del ElastoSens™ Bio. El tiempo inicial de reticulación se determinó a partir del punto de cruce entre G’ y G’’ (tan(δ) = 1).
La rigidez del hidrogel influye en el comportamiento celular
Resultados y discusión
Las ECM LunaGel™ reticulables por luz se evaluaron primero en cuanto a sus propiedades viscoelásticas, que se pueden describir mediante el módulo de almacenamiento al cizallamiento (G’ —la parte elástica del comportamiento viscoelástico—) y el módulo de pérdida al cizallamiento (G’’ —la parte viscosa del comportamiento viscoelástico—). Normalmente también se calcula la relación entre G’’ y G’ (factor de amortiguamiento o tan(δ)) para ver qué comportamiento predomina.
La fig. 1 muestra la evolución del módulo de almacenamiento de cizallamiento (G’) en función del tiempo de reticulación para las MEC fotoreticulables LunaGel™ de baja y alta rigidez, tanto porcinas (izquierda) como bovinas (derecha). Las mediciones se realizaron sin exposición a la luz durante los primeros 2 minutos de la prueba. A continuación, se programó el encendido de la luz mediante el instrumento ElastoSens™ Bio a los 2 minutos y su efecto se observó claramente con el aumento de G’ a partir de ese momento y hasta los 12 minutos (cuando se apagó la luz). Las mediciones continuaron durante unos 15 minutos para determinar las propiedades viscoelásticas finales del gel. Las muestras quedaron reticuladas de forma homogénea tras el ensayo (fig. 2).
Fig. 1: Módulo de almacenamiento al cizallamiento (G’, Pa) en función del tiempo para los productos de MEC LunaGel™ de origen porcino (izquierda) y bovino (derecha).
Fig. 2: Ejemplo representativo de una muestra de LunaGel™ tras la prueba.
La reticulación por luz empezó tras unos 0,5 min de exposición a la luz en el caso de los hidrogeles de alta rigidez y tras unos 1,5 min en los de baja rigidez (fig. 3). El valor final de G’ fue aproximadamente 8 veces mayor en las formulaciones de alta rigidez que en las de baja rigidez. Las formulaciones de baja rigidez formaron geles blandos con un G’ de ~550 Pa, mientras que los hidrogeles de alta rigidez alcanzaron ~4 500 Pa y no se observaron diferencias estadísticas entre las fuentes porcina y bovina. Sin embargo, se observaron diferencias significativas entre las formulaciones de baja y alta rigidez para ambos tipos de gelatina. De hecho, los productos LunaGel™ de baja y alta rigidez contienen diferentes concentraciones de los componentes de gelatina modificada para permitir un control preciso sobre un amplio rango de rigidez. El valor final de tan(δ) fue siempre inferior a 0,1, lo que demuestra que el comportamiento elástico (relacionado con el módulo de almacenamiento de cizallamiento, G’’) es mucho más predominante que el comportamiento viscoso (relacionado con el módulo de pérdida de cizallamiento, G’’) en estos hidrogeles.
Fig. 3: Tiempo inicial de reticulación (min), G’ final (Pa) y tan(δ) final de los geles fotoreticulados.
Tanto para las formulaciones de baja como de alta rigidez, se puede variar la duración de la exposición a la luz para alcanzar las rigidezes deseadas, que sean inferiores o iguales al valor final de G’. La fig. 4 muestra la evolución del módulo de almacenamiento al cizallamiento (G’, Pa) en función del tiempo para el LunaGel™ porcino de alta rigidez reticulado con 9,0 mW/cm² durante 2, 4, 8 y 10 minutos, respectivamente. Del mismo modo, se programó que la luz se encendiera tras 2 minutos de ensayo con la duración mencionada. Como era de esperar, las curvas fueron prácticamente iguales durante los primeros 4 minutos. Pasado ese tiempo, el G’ siguió aumentando considerablemente con el paso del tiempo en las muestras sometidas a una exposición a la luz más prolongada.
Fig. 4: Módulo de almacenamiento de cizallamiento (G’, Pa) en función del tiempo para el LunaGel™ porcino de alta rigidez reticulado con luz de 405 nm (9,0 mW/cm²) durante 2, 4, 8 y 10 minutos.
Para analizar cómo afecta la rigidez de la MEC de LunaGel al comportamiento de las células de cáncer de mama, se sembraron esferoides de MDA-MB-231 en MEC con un módulo de almacenamiento de cizallamiento (G’) de ~110, 220 y 440 kPa, respectivamente. Tras 7 días de cultivo, se observaron diferencias sustanciales en las morfologías celulares entre las diferentes rigidezes de la MEC (fig. 5). La capacidad invasiva de las células de cáncer de mama aumentó en función de la rigidez de la MEC, lo que corrobora los datos clínicos que sugieren que la metástasis se produce con mayor frecuencia en los cánceres de mama con tejidos más rígidos. Se observó un cambio hacia morfologías celulares más migratorias, asociadas a la metástasis (fig. 5, recuadros ampliados), a medida que aumentaba la rigidez de la MEC de LunaGel.
Fig. 5: La capacidad invasiva de las células de cáncer de mama aumenta con la rigidez de la MEC. Las imágenes muestran esferoides de MDA-MB-231 sembrados en MEC de gelatina bovina LunaGel con un módulo de almacenamiento de cizallamiento de (A) 110 Pa, (B) 220 Pa y (C) 440 Pa, respectivamente, tras 7 días de cultivo. Las células/esferoides se tiñeron para visualizar los núcleos celulares (azul), la integrina β1 (verde), la membrana celular (naranja) y la actina (magenta).
Conclusiones
La evolución viscoelástica de los productos ECM LunaGel™ de Gelomics durante la reticulación fotoquímica se registró con éxito en tiempo real usando ElastoSens™ Bio. El valor final de G’ fue aproximadamente 8 veces mayor en las formulaciones de alta rigidez en comparación con las de baja rigidez. Las propiedades viscoelásticas finales de estos hidrogeles se pudieron ajustar fácilmente variando el tiempo de exposición a la luz durante la reticulación (405 nm). La capacidad invasiva de las células de cáncer de mama aumentó significativamente con la rigidez de la ECM, lo que demuestra que el sistema LunaGel™ es capaz de imitar fielmente las condiciones fisiológicas y fisiopatológicas de los tejidos.
Resumen
- Los productos LunaGel™ facilitan el desarrollo de hidrogeles con la rigidez deseada.
- ElastoSens™ Bio puede aplicar luz (a diferentes longitudes de onda) durante la medición de la viscoelasticidad de los hidrogeles, lo que permite conocer la cinética de su reticulación fotoquímica en tiempo real.
- En el ElastoSens™ Bio se pueden combinar fácilmente las intensidades de luz y los tiempos de exposición durante el fotoreticulado de los hidrogeles para alcanzar la viscoelasticidad deseada para cada aplicación concreta.
- Las ECM de LunaGel™ facilitan el estudio del comportamiento celular en función de la rigidez de la ECM.
Referencias
[1] Keely, P., & Nain, A. (2015). Capturing relevant extracellular matrices for investigating cell migration. F1000Research, 4.
[2] Wei, S. C., Fattet, L., Tsai, J. H., Guo, Y., Pai, V. H., Majeski, H. E., … & Yang, J. (2015). Matrix stiffness drives epithelial–mesenchymal transition and tumour metastasis through a TWIST1–G3BP2 mechanotransduction pathway. Nature cell biology, 17(5), 678-688.
[3] Paszek, M. J., Zahir, N., Johnson, K. R., Lakins, J. N., Rozenberg, G. I., Gefen, A., … & Weaver, V. M. (2005). Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell, 8(3), 241-254.
[4] Caliari, S. R., & Burdick, J. A. (2016). A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature methods, 13(5), 405-414.
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