Nota de Aplicação | ElastoSens™ Bio
Ajuste da rigidez dos hidrogéis de ECM com o ElastoSens™ Bio
Em colaboração com
Nota
Este estudo foi uma colaboração conjunta entre a Rheolution (QC, Canadá) e a Gelomics (QLD, Austrália).
por Gloria Pinilla, M.Sc., Especialista Sênior em Aplicações da Rheolution Inc.
Resumo
- A rigidez inicial dos sistemas de cultura 3D pode ser ajustada para estudar processos fisiológicos e patológicos in vitro.
- Os hidrogéis fotocrosslinkáveis são excelentes candidatos para sistemas de cultura 3D devido à sua semelhança com a matriz extracelular natural e à facilidade de controlar sua rigidez final.
- Os produtos de matriz extracelular LunaGel™ da Gelomics foram fotoreticulados com sucesso com luz visível, e sua cinética de reticulação foi medida em tempo real no ElastoSens™ Bio.
- As reações de fotocrosslinking ocorreram rapidamente tanto nos kits LunaGel™ de baixa quanto nos de alta rigidez.
- Os kits LunaGel™ de alta rigidez apresentaram maior rigidez do que os kits de baixa rigidez.
- A rigidez das matrizes de LunaGel™ aumentou com o tempo de fotoreticulação.
- A invasividade das células do câncer de mama aumentou significativamente com o aumento da rigidez da MEC.
O papel da rigidez do hidrogel no comportamento celular
Introdução
Todas as células do corpo humano estão expostas a forças mecânicas que regulam a função celular e o desenvolvimento dos tecidos, e cada tipo de célula está especificamente adaptado às propriedades mecânicas do tecido em que se encontra. As propriedades da matriz dos tecidos humanos também podem se alterar com a doença e, por sua vez, facilitar sua progressão. Por exemplo, o crescimento, a sobrevivência, a diferenciação e a morfogênese das células epiteliais mamárias normais são amplamente favorecidos pela interação com uma matriz macia, semelhante à rigidez do tecido mamário normal. Após a transformação durante o câncer de mama, no entanto, o tecido torna-se progressivamente mais rígido [1] e as células tumorais tornam-se significativamente mais contráteis e hiper-responsivas aos estímulos mecânicos da matriz, levando, em última instância, à transição epitelial-mesenquimal (EMT) e à metástase [2,3]. A investigação mecanicista da complexa interação entre as propriedades do substrato e o comportamento celular requer metodologias avançadas de cultura celular que superem as limitações associadas às abordagens tradicionais de cultura [4].
As matrizes extracelulares (ECMs) LunaGel™ da Gelomics são hidrogéis fotocrosslinkáveis que proporcionam um sistema controlado de cultura celular 3D para o estudo de processos patológicos e fisiológicos in vitro. Baseadas em componentes da MCE, como colágeno dos tipos I, III, IV e V, bem como glicoproteínas e proteoglicanos do tecido conjuntivo, essas MCE imitam fielmente a matriz extracelular (MCE) natural que envolve as células no corpo humano e facilitam a adesão, proliferação, diferenciação e migração celular, além da degradação proteolítica da MCE. Além disso, o processo de reticulação fotoquímica permite que os cientistas tenham maior controle sobre a rigidez final do gel. Simplesmente variando a duração da reticulação, a rigidez do gel pode ser ajustada com precisão para imitar tecidos moles e duros, como o cérebro, o fígado, a mama e a cartilagem, entre outros, tanto em condições saudáveis quanto patológicas. Por essas razões, eles são substratos ideais para a cultura e diferenciação de uma ampla variedade de tipos de células e facilitam a análise das alterações no comportamento celular induzidas pela rigidez da matriz.
O ElastoSens™ Bio mede, sem contato, as propriedades viscoelásticas de materiais macios. Ao aplicar vibrações suaves à amostra, o instrumento é capaz de registrar a cinética de fotoreticulação no comprimento de onda desejado. Nesta nota de aplicação, os ECMs LunaGel™, baseados em pele suína quimicamente modificada e gelatina de osso bovino, foram submetidos à fotoreticulação, enquanto sua cinética de reticulação foi avaliada em tempo real no ElastoSens™ Bio. Para investigar a adequação das MECs LunaGel™ para simular alterações fisiopatológicas na rigidez tecidual e seus efeitos na progressão do câncer, esferóides de câncer de mama foram cultivados em substratos de rigidez variável e suas morfologias foram observadas.
Fotoreticulação de hidrogéis LunaGel™ pela Gelomics
Materiais e Métodos
Os ECMs LunaGel™ à base de gelatina de pele suína quimicamente modificada, tipo A (LunaGel™ – Gelatina de Pele Suína – baixa e alta rigidez, Gelomics) e gelatina de osso bovino, tipo B (LunaGel™ – Gelatina de Osso Bovino – baixa e alta rigidez, Gelomics), foram preparadas de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, os frascos de fotoiniciador foram dissolvidos em PBS e misturados com as soluções de ECM fotocrosslinkáveis a 37 °C. 2 mL dos produtos foram pipetados no porta-amostra do ElastoSens™ Bio e o teste de viscoelasticidade foi iniciado imediatamente a 37 °C, utilizando as seguintes sequências de medição:
O módulo de elasticidade ao cisalhamento (G’) e tan(δ) foram obtidos diretamente do ElastoSens™ Bio. O tempo inicial de reticulação foi determinado a partir do ponto de cruzamento entre G’ e G’’ (tan(δ) = 1).
A rigidez do hidrogel influencia o comportamento celular
Resultados e Discussão
As ECMs LunaGel™ fotocrosslinkáveis foram avaliadas inicialmente em termos de propriedades viscoelásticas, que podem ser descritas pelo módulo de armazenamento ao cisalhamento (G’ — porção elástica do comportamento viscoelástico) e pelo módulo de perda ao cisalhamento (G’’ — porção viscosa do comportamento viscoelástico). A razão entre G’’ e G’ (fator de amortecimento ou tan(δ)) também é normalmente determinada para indicar qual comportamento é predominante.
A Fig. 1 mostra a evolução do módulo de armazenamento de cisalhamento (G’) em função do tempo de reticulação para MECs LunaGel™ fotocrosslinkáveis de baixa e alta rigidez, provenientes de suínos (à esquerda) e bovinos (à direita). As medições foram realizadas sem exposição à luz durante os primeiros 2 minutos do teste. A luz foi então programada para ser acesa pelo instrumento ElastoSens™ Bio aos 2 minutos, e seu efeito foi claramente observado com o aumento de G’ após esse momento, até os 12 minutos (quando a luz foi desligada). As medições foram continuadas por cerca de 15 minutos para identificar as propriedades viscoelásticas finais do gel. As amostras apresentaram reticulação homogênea após o teste (Fig. 2).
Fig. 1: Módulo de armazenamento de cisalhamento (G’, Pa) em função do tempo para os produtos LunaGel™ ECM de origem suína (à esquerda) e bovina (à direita).
Fig. 2: Exemplo representativo de uma amostra de LunaGel™ após o teste.
A reticulação por luz teve início após cerca de 0,5 min de exposição à luz para os hidrogéis de alta rigidez e cerca de 1,5 min para os de baixa rigidez (Fig. 3). O valor final de G’ foi aproximadamente 8 vezes maior nas formulações de alta rigidez em comparação com as de baixa rigidez. As formulações de baixa rigidez formaram géis macios com um G’ de ~550 Pa, enquanto os hidrogéis de alta rigidez atingiram ~4.500 Pa, não tendo sido observada diferença estatística entre as fontes suína e bovina. No entanto, foram observadas diferenças significativas entre as formulações de baixa e alta rigidez para ambos os tipos de gelatina. De fato, os produtos LunaGel™ de baixa e alta rigidez contêm concentrações diferentes dos componentes de gelatina modificada para permitir um controle preciso sobre uma ampla faixa de rigidez. O valor final de tan(δ) foi sempre inferior a 0,1, demonstrando que o comportamento elástico (relacionado ao módulo de armazenamento de cisalhamento, G’’) é muito mais predominante do que o comportamento viscoso (relacionado ao módulo de perda de cisalhamento, G’’) nesses hidrogéis.
Fig. 3: Tempo inicial de reticulação (min), G’ final (Pa) e tan(δ) final dos géis reticulados por fotorreticulação.
Tanto para formulações de baixa quanto de alta rigidez, a duração da exposição à luz pode ser variada para atingir os valores-alvo de rigidez desejados, que sejam inferiores ou iguais ao valor final de G’. A Fig. 4 mostra a evolução do módulo de armazenamento de cisalhamento (G’, Pa) em função do tempo para o LunaGel™ suíno de alta rigidez, reticulado com 9,0 mW/cm² por 2, 4, 8 e 10 minutos, respectivamente. Da mesma forma, a luz foi programada para ser acesa após 2 minutos de teste com a duração mencionada. Como esperado, as curvas foram praticamente idênticas durante os primeiros 4 minutos. Após esse ponto no tempo, o G’ continuou a aumentar substancialmente com o tempo para as amostras submetidas a uma exposição mais prolongada à luz.
Fig. 4: Módulo de armazenamento de cisalhamento (G’, Pa) em função do tempo para o LunaGel™ suíno de alta rigidez, reticulado com luz de 405 nm (9,0 mW/cm²) por 2, 4, 8 e 10 minutos.
Para examinar os efeitos da rigidez da MEC do LunaGel no comportamento das células de câncer de mama, esferóides de MDA-MB-231 foram semeados em MECs com módulo de armazenamento de cisalhamento (G’) de ~ 110, 220 e 440 kPa, respectivamente. Após 7 dias de cultura, observaram-se diferenças substanciais nas morfologias celulares entre os diferentes níveis de rigidez da MEC (Fig. 5). A invasividade das células de câncer de mama aumentou em função da rigidez da MEC, corroborando dados clínicos que sugerem a ocorrência preferencial de metástases no câncer de mama com maior rigidez tecidual. Observou-se uma mudança para morfologias celulares mais migratórias, associadas à metástase (Fig. 5, inserções ampliadas), com o aumento da rigidez da MEC do LunaGel.
Fig. 5: A invasividade das células do câncer de mama aumenta com a rigidez da MEC. As imagens mostram esferóides de MDA-MB-231 semeados em MECs de gelatina bovina LunaGel com módulo de armazenamento de cisalhamento de (A) 110 Pa, (B) 220 Pa e (C) 440 Pa, respectivamente, após 7 dias de cultura. As células/esferóides foram coradas para visualização dos núcleos celulares (azul), da integrina β1 (verde), da membrana celular (laranja) e da actina (magenta).
Conclusões
A evolução viscoelástica dos produtos ECM LunaGel™ da Gelomics durante a fotoreticulação foi capturada com sucesso em tempo real utilizando o ElastoSens™ Bio. O valor final de G’ foi aproximadamente 8 vezes maior nas formulações de alta rigidez em comparação com as de baixa rigidez. As propriedades viscoelásticas finais desses hidrogéis foram facilmente ajustadas variando-se o tempo de exposição à luz durante a reticulação (405 nm). A invasividade das células de câncer de mama aumentou significativamente com a rigidez da ECM, demonstrando a capacidade do sistema LunaGel™ de imitar fielmente as condições fisiológicas e fisiopatológicas dos tecidos.
Resumo
- Os produtos LunaGel™ facilitam o desenvolvimento de hidrogéis com a rigidez desejada.
- O ElastoSens™ Bio é capaz de aplicar luz (em diferentes comprimentos de onda) durante a medição da viscoelasticidade de hidrogéis, fornecendo a cinética de fotoreticulação em tempo real.
- As intensidades de luz e os tempos de exposição durante a fotoreticulação de hidrogéis podem ser facilmente combinados no ElastoSens™ Bio para atingir a viscoelasticidade desejada para a aplicação específica.
- As MECs LunaGel™ facilitam o estudo do comportamento celular em função da rigidez da MEC.
Referências
[1] Keely, P., & Nain, A. (2015). Capturing relevant extracellular matrices for investigating cell migration. F1000Research, 4.
[2] Wei, S. C., Fattet, L., Tsai, J. H., Guo, Y., Pai, V. H., Majeski, H. E., … & Yang, J. (2015). Matrix stiffness drives epithelial–mesenchymal transition and tumour metastasis through a TWIST1–G3BP2 mechanotransduction pathway. Nature cell biology, 17(5), 678-688.
[3] Paszek, M. J., Zahir, N., Johnson, K. R., Lakins, J. N., Rozenberg, G. I., Gefen, A., … & Weaver, V. M. (2005). Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell, 8(3), 241-254.
[4] Caliari, S. R., & Burdick, J. A. (2016). A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature methods, 13(5), 405-414.
Descubra como nossa tecnologia mede, de forma não destrutiva, as propriedades viscoelásticas de biomateriais e tecidos moles utilizando microvolumes de amostras
Posts Relacionados
Todas as células do corpo humano estão expostas a forças mecânicas que regulam o funcionamento celular e o desenvolvimento dos tecidos, e cada tipo de célula está especificamente adaptado às propriedades mecânicas do tecido em que se encontra. As propriedades da matriz dos tecidos humanos também podem se alterar com a doença e, por sua vez, facilitar sua progressão.