Note d’application | ElastoSens™ Bio
Réglage de la rigidité des hydrogels ECM à l'aide d'ElastoSens™ Bio
En collaboration avec
Avis
Cette étude est le fruit d’une collaboration entre Rheolution (Québec, Canada) et Gelomics (Queensland, Australie).
par Gloria Pinilla, M.Sc., spécialiste senior des applications,
Rheolution Inc.
Résumé
- La rigidité initiale des systèmes de culture en 3D peut être modulée afin d’étudier des processus physiologiques et pathologiques in vitro.
- Les hydrogels photoréticulables constituent d’excellents candidats pour les systèmes de culture en 3D en raison de leur similitude avec la matrice extracellulaire naturelle et de la facilité avec laquelle il est possible de contrôler leur rigidité finale.
- Les produits LunaGel™ à base de matrice extracellulaire de Gelomics ont été photoréticulés avec succès à la lumière visible et leur cinétique de réticulation a été mesurée en temps réel à l’aide de l’ElastoSens™ Bio.
- Les réactions de photoréticulation se sont déroulées rapidement, tant avec le kit LunaGel™ à faible rigidité qu’avec celui à haute rigidité.
- Les kits LunaGel™ à haute rigidité ont permis d’obtenir une rigidité supérieure à celle des kits à faible rigidité.
- La rigidité des matrices LunaGel™ augmentait avec la durée de la photoréticulation.
- Le caractère invasif des cellules cancéreuses du sein augmentait considérablement avec la rigidité de la matrice extracellulaire.
Le rôle de la rigidité de l'hydrogel dans le comportement cellulaire
Introduction
Toutes les cellules du corps humain sont soumises à des forces mécaniques qui régulent leur fonctionnement et le développement des tissus, et chaque type de cellule est spécifiquement adapté aux propriétés mécaniques du tissu dans lequel elle se trouve. Les propriétés de la matrice des tissus humains peuvent également évoluer en cas de maladie et, à leur tour, favoriser la progression de celle-ci. Par exemple, la croissance, la survie, la différenciation et la morphogenèse des cellules épithéliales mammaires normales sont largement favorisées par l’interaction avec une matrice souple dont la rigidité est similaire à celle du tissu mammaire normal. Cependant, à la suite de la transformation survenant lors d’un cancer du sein, le tissu devient progressivement plus rigide [1] et les cellules tumorales acquièrent une contractilité nettement accrue ainsi qu’une hyperréactivité aux signaux mécaniques de la matrice, ce qui conduit finalement à la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) et à la métastase [2,3]. L’étude mécanistique de l’interaction complexe entre les propriétés du substrat et le comportement cellulaire nécessite des méthodologies avancées de culture cellulaire qui surmontent les limites associées aux approches de culture traditionnelles [4].
Les matrices extracellulaires (MEC) LunaGel™ de Gelomics sont des hydrogels photoréticulables qui offrent un système de culture cellulaire en 3D contrôlé permettant d’étudier in vitro des processus pathologiques et physiologiques. Composées d’éléments de la matrice extracellulaire (MEC) tels que les collagènes de types I, III, IV et V, ainsi que des glycoprotéines et des protéoglycanes du tissu conjonctif, ces MEC reproduisent fidèlement la matrice extracellulaire naturelle entourant les cellules du corps humain et facilitent l’adhésion, la prolifération, la différenciation et la migration cellulaires, ainsi que la dégradation protéolytique de la MEC. De plus, le processus de photoréticulation permet aux scientifiques de mieux contrôler la rigidité finale du gel. En modifiant simplement la durée de la photoréticulation, la rigidité du gel peut être ajustée avec précision pour imiter des tissus mous et durs tels que le cerveau, le foie, le sein ou le cartilage, entre autres, tant dans des conditions saines que pathologiques. Pour ces raisons, ils constituent des substrats idéaux pour la culture et la différenciation d’un large éventail de types cellulaires et facilitent l’étude des modifications du comportement cellulaire induites par la rigidité de la matrice.
ElastoSens™ Bio mesure sans contact les propriétés viscoélastiques des matériaux souples. En appliquant de légères vibrations à l’échantillon, l’instrument est capable d’enregistrer la cinétique de photoréticulation à la longueur d’onde souhaitée. Dans cette note d’application, des ECM LunaGel™ à base de gélatine de peau porcine et d’os bovin chimiquement modifiées ont été toutes deux photoréticulées, tandis que leur cinétique de réticulation a été évaluée en temps réel à l’aide de l’ElastoSens™ Bio. Afin d’étudier la capacité des MEC LunaGel™ à reproduire les modifications physiopathologiques de la rigidité tissulaire et leurs effets sur la progression du cancer, des sphéroïdes de cancer du sein ont été cultivés sur des substrats de rigidité variable, et leurs morphologies ont été observées.
Réticulation par exposition à la lumière des hydrogels LunaGel™ par Gelomics
Matériel et méthodes
Les ECM LunaGel™ à base de gélatine de peau porcine modifiée chimiquement, de type A (LunaGel™ – Gélatine de peau porcine – faible et haute rigidité, Gelomics) et de gélatine d’os bovin, de type B (LunaGel™ – Gélatine d’os bovin – faible et haute rigidité, Gelomics), ont été préparés conformément aux instructions du fabricant. En bref, les flacons de photo-initiateur ont été dissous dans du PBS et mélangés aux solutions d’ECM photoréticulables à 37 °C. 2 ml des produits ont été pipetés dans le porte-échantillon de l’ElastoSens™ Bio et l’essai de viscoélasticité a été immédiatement lancé à 37 °C en utilisant les séquences de mesure suivantes :
Le module d’élasticité de cisaillement (G’) et la tangente de δ (tan(δ)) ont été obtenus directement à partir de l’ElastoSens™ Bio. Le temps de réticulation initial a été déterminé à partir du point d’intersection entre G’ et G’’ (tan(δ) = 1).
La rigidité de l'hydrogel influence le comportement des cellules
Résultats et discussion
Les ECM LunaGel™ photoréticulables ont tout d’abord été évaluées en termes de propriétés viscoélastiques, qui peuvent être décrites par le module de stockage en cisaillement (G’ — composante élastique du comportement viscoélastique) et le module de perte en cisaillement (G’’ — composante visqueuse du comportement viscoélastique). Le rapport entre G’’ et G’ (facteur d’amortissement ou tan(δ)) est également généralement déterminé afin de mettre en évidence quel comportement est prédominant.
La figure 1 illustre l’évolution du module de stockage en cisaillement (G’) en fonction du temps de réticulation pour des MEC LunaGel™ photoréticulables de faible et de forte rigidité, d’origine porcine (à gauche) et bovine (à droite). Les mesures ont été effectuées sans exposition à la lumière pendant les deux premières minutes de l’essai. L’allumage de la lumière a ensuite été programmé par l’instrument ElastoSens™ Bio à 2 minutes, et son effet a été clairement observé par l’augmentation de G’ après ce moment, jusqu’à 12 minutes (lorsque la lumière a été éteinte). Les mesures se sont poursuivies pendant environ 15 minutes afin de déterminer les propriétés viscoélastiques finales du gel. Les échantillons présentaient une réticulation homogène à l’issue de l’essai (Fig. 2).
Fig. 1: Module de stockage en cisaillement (G’, Pa) en fonction du temps pour les produits ECM LunaGel™ d’origine porcine (à gauche) et bovine (à droite).
Fig. 2: Exemple représentatif d’un échantillon de LunaGel™ après l’essai.
La photoréticulation a commencé après environ 0,5 minute d’exposition à la lumière pour les hydrogels à haute rigidité et après environ 1,5 minute pour ceux à faible rigidité (fig. 3). La valeur finale de G’ était environ 8 fois plus élevée pour les formulations à haute rigidité que pour celles à faible rigidité. Les formulations à faible rigidité ont formé des gels souples présentant un G’ d’environ 550 Pa, tandis que les hydrogels à haute rigidité ont atteint environ 4 500 Pa ; aucune différence statistiquement significative n’a été constatée entre les sources porcine et bovine. Toutefois, des différences significatives entre les formulations à faible et à haute rigidité ont été observées pour les deux types de gélatine. En effet, les produits LunaGel™ à faible et à haute rigidité contiennent des concentrations différentes des composants de gélatine modifiée afin de permettre un contrôle précis sur une large plage de rigidité. La valeur finale de tan(δ) était toujours inférieure à 0,1, ce qui montre que le comportement élastique (lié au module de stockage en cisaillement, G’’) est nettement plus prédominant que le comportement visqueux (lié au module de perte en cisaillement, G’’) dans ces hydrogels.
Fig. 3: Durée initiale de réticulation (min), valeur finale de G’ (Pa) et valeur finale de tan(δ) des gels photoréticulés.
Tant pour les formulations à faible rigidité que pour celles à haute rigidité, la durée d’exposition à la lumière peut être modifiée afin d’atteindre les rigidités cibles souhaitées, qui sont inférieures ou égales à la valeur finale de G’. La figure 4 illustre l’évolution du module de stockage en cisaillement (G’, Pa) en fonction du temps pour le LunaGel™ porcin à haute rigidité, réticulé à une puissance de 9,0 mW/cm² pendant respectivement 2, 4, 8 et 10 minutes. De même, la lumière a été programmée pour s’allumer après 2 minutes d’essai, avec les durées mentionnées. Comme prévu, les courbes étaient pratiquement identiques au cours des 4 premières minutes. Passé ce moment, le G’ a continué à augmenter de manière substantielle au fil du temps pour les échantillons soumis à une exposition à la lumière plus longue.
Fig. 4: Module de stockage en cisaillement (G’, Pa) en fonction du temps pour le LunaGel™ porcin à haute rigidité, réticulé par une lumière de 405 nm (9,0 mW/cm²) pendant 2, 4, 8 et 10 minutes.
Afin d’étudier les effets de la rigidité de la MEC LunaGel sur le comportement des cellules cancéreuses du sein, des sphéroïdes MDA-MB-231 ont été ensemencés sur des MEC présentant un module de stockage en cisaillement (G’) d’environ 110, 220 et 440 kPa, respectivement. Au bout de 7 jours de culture, des différences notables dans les morphologies cellulaires ont été observées entre les différentes rigidités de la MEC (fig. 5). Le caractère invasif des cellules cancéreuses du sein augmentait en fonction de la rigidité de la MEC, ce qui corrobore les données cliniques suggérant une survenue préférentielle de métastases dans les cancers du sein présentant une plus grande rigidité tissulaire. Une évolution vers des morphologies cellulaires plus migratrices, associées aux métastases (fig. 5, encarts agrandis), a été observée à mesure que la rigidité de la MEC LunaGel augmentait.
Fig. 5: Le caractère invasif des cellules cancéreuses du sein augmente avec la rigidité de la matrice extracellulaire (MEC). Les images montrent des sphéroïdes MDA-MB-231 ensemencés sur des MEC à base de gélatine bovine LunaGel présentant un module de stockage en cisaillement de (A) 110 Pa, (B) 220 Pa et (C) 440 Pa, respectivement, après 7 jours de culture. Les cellules/sphéroïdes ont été colorés pour mettre en évidence les noyaux cellulaires (bleu), l’intégrine β1 (vert), la membrane cellulaire (orange) et l’actine (magenta).
Conclusions
L’évolution viscoélastique des produits ECM LunaGel™ de Gelomics au cours de la photoréticulation a été mesurée avec succès en temps réel à l’aide d’ElastoSens™ Bio. La valeur finale de G’ était environ 8 fois plus élevée pour les formulations à haute rigidité que pour celles à faible rigidité. Les propriétés viscoélastiques finales de ces hydrogels ont été facilement ajustées en modifiant la durée d’exposition à la lumière pendant la réticulation (405 nm). L’invasivité des cellules cancéreuses du sein a augmenté de manière significative avec la rigidité de l’ECM, démontrant ainsi la capacité du système LunaGel™ à reproduire fidèlement les conditions tissulaires physiologiques et physiopathologiques.
Résumé
- Les produits LunaGel™ permettent de mettre au point des hydrogels présentant la rigidité souhaitée.
- ElastoSens™ Bio est capable d’appliquer de la lumière (à différentes longueurs d’onde) pendant la mesure de la viscoélasticité des hydrogels, ce qui permet d’obtenir en temps réel la cinétique de leur photoréticulation.
- Les intensités lumineuses et les durées d’exposition lors de la photoréticulation des hydrogels peuvent être facilement combinées dans l’ElastoSens™ Bio afin d’atteindre la viscoélasticité souhaitée pour l’application concernée.
- Les ECM LunaGel™ facilitent l’étude du comportement cellulaire en fonction de la rigidité de la matrice extracellulaire.
Références
[1] Keely, P., & Nain, A. (2015). Capturing relevant extracellular matrices for investigating cell migration. F1000Research, 4.
[2] Wei, S. C., Fattet, L., Tsai, J. H., Guo, Y., Pai, V. H., Majeski, H. E., … & Yang, J. (2015). Matrix stiffness drives epithelial–mesenchymal transition and tumour metastasis through a TWIST1–G3BP2 mechanotransduction pathway. Nature cell biology, 17(5), 678-688.
[3] Paszek, M. J., Zahir, N., Johnson, K. R., Lakins, J. N., Rozenberg, G. I., Gefen, A., … & Weaver, V. M. (2005). Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell, 8(3), 241-254.
[4] Caliari, S. R., & Burdick, J. A. (2016). A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature methods, 13(5), 405-414.
Découvrez comment notre technologie mesure de manière non destructive les propriétés viscoélastiques des biomatériaux mous et des tissus en utilisant des micro-volumes d’échantillons
Articles connexes
Toutes les cellules du corps humain sont exposées à des forces mécaniques qui régulent leur fonctionnement et le développement des tissus, et chaque type de cellule est spécifiquement adapté aux propriétés mécaniques du tissu dans lequel il se trouve. Les propriétés de la matrice des tissus humains peuvent également évoluer en cas de maladie et, à leur tour, favoriser sa progression.