アプリケーションノート | ElastoSens™ Bio

ElastoSens™ Bio を用いた ECM ハイドロゲルの剛性の調整

協力：

お知らせ

本研究は、Rheolution社（カナダ・ケベック州）とGelomics社（オーストラリア・クイーンズランド州）による共同研究である。

by Gloria Pinilla, M.Sc.
Rheolution Inc.のシニアアプリケーションスペシャリスト

概要

3次元培養システムの初期剛性を変化させることで、in vitroで生理学的および病理学的プロセスを研究することができる。
光重合性ハイドロゲルは、天然の細胞外マトリックスと類似していること、また最終的な硬さを制御しやすいことから、3D培養システムに最適な候補である。
Gelomics社のLunaGel™細胞外マトリックス製品は、可視光による光架橋に成功し、ElastoSens™ Bioを用いてその架橋動態がリアルタイムで測定された。
光架橋反応は、「Low Stiffness LunaGel™キット」と「High Stiffness LunaGel™キット」の双方において、迅速に進行した。
高剛性LunaGel™キットは、低剛性キットよりも高い剛性を示した。
LunaGel™マトリックスの剛性は、光架橋時間の長さに伴って増加した。
ECMの硬さが増すにつれて、乳がん細胞の浸潤性は著しく高まった。

細胞の挙動におけるハイドロゲルの硬さの役割

はじめに

人体のすべての細胞は、細胞機能や組織の発達を調節する機械的力にさらされており、各細胞の種類は、それらが存在する組織の機械的特性に特異的に適応しています。また、ヒト組織のマトリックス特性は疾患によって変化し、ひいては疾患の進行を促進することもあります。例えば、正常な乳腺上皮細胞の増殖、生存、分化、および形態形成は、正常な乳房組織の硬度に似た柔らかいマトリックスとの相互作用によって十分に支えられている。しかし、乳がんへの転化に伴い、組織は徐々に硬くなり[1]、腫瘍細胞は著しく収縮性が高まり、マトリックスの機械的シグナルに対して過敏に反応するようになり、最終的には上皮間葉転換（EMT）や転移を引き起こします[2,3]。基質の特性と細胞の挙動との間の複雑な相互作用のメカニズムを解明するには、従来の培養法に伴う制限を克服した、高度な細胞培養手法が必要となる [4]。

Gelomics社のLunaGel™細胞外マトリックス（ECM）は、光架橋可能なハイドロゲルであり、in vitroでの病理学的および生理学的プロセスを研究するための制御された3次元細胞培養システムを提供します。 I型、III型、IV型、V型コラーゲン、ならびに結合組織グリコプロテインやプロテオグリカンといったECM成分を基盤とするこれらのECMは、人体内の細胞を取り巻く天然の細胞外マトリックス（ECM）を忠実に模倣しており、細胞の付着、増殖、分化、遊走、およびECMのタンパク質分解による分解を促進します。さらに、光架橋プロセスにより、科学者は最終的な硬さをより細かく制御できるようになります。架橋時間を調整するだけで、ゲルの硬さを微調整し、健康時および疾患時の状態における脳、肝臓、乳房、軟骨などの軟組織や硬組織を模倣することが可能です。これらの理由から、これらのゲルは幅広い種類の細胞の培養および分化に理想的な基質であり、マトリックスの硬さが細胞の挙動に及ぼす変化の解析を容易にします。

ElastoSens™ Bioは、軟質材料の粘弾性特性を非接触で測定します。試料に微弱な振動を与えることで、本装置は所望の波長における光架橋の速度論を記録することができます。本アプリケーションノートでは、化学修飾されたブタ皮およびウシ骨由来のゼラチンを基材とするLunaGel™ ECMを光架橋させ、ElastoSens™ Bioを用いてその架橋動態をリアルタイムで評価しました。 LunaGel™ ECM が、組織の硬さにおける病態生理学的変化を模倣することの適性、およびそれががんの進行に及ぼす影響を調査するため、硬さの異なる基板上で乳がんスフェロイドを培養し、その形態を観察しました。

GelomicsによるLunaGel™ハイドロゲルの光架橋

材料および方法

化学修飾されたブタ皮ゼラチン（タイプA）（LunaGel™ – ブタ皮ゼラチン – 低剛性および高剛性、Gelomics）およびウシ骨ゼラチン（タイプB）（LunaGel™ – ウシ骨ゼラチン – 低剛性および高剛性、 Gelomics）を基にしたLunaGel™ ECMは、製造元の指示に従って調製した。簡単に説明すると、光開始剤のバイアルをPBSに溶解し、37 °Cで光架橋可能なECM溶液と混合した。得られた試料2 mLをElastoSens™ Bioのサンプルホルダーにピペットで注入し、直ちに37 °Cで以下の測定シーケンスを用いて粘弾性試験を開始した：

せん断弾性率（G’）およびtan(δ)は、ElastoSens™ Bioから直接得られた。初期架橋時間は、G’とG’’の交点（tan(δ) = 1）から決定した。

ハイドロゲルの硬さは細胞の挙動に影響を与える

結果と考察

光重合性LunaGel™ ECMについては、まず、せん断貯蔵弾性率（G’：粘弾性挙動の弾性成分）およびせん断損失弾性率（G’’：粘弾性挙動の粘性成分）によって表される粘弾性特性について評価を行った。また、G’’とG’の比（減衰係数、またはtan(δ)）も、どちらの挙動が優勢であるかを示すために通常算出される。

図1は、低剛性および高剛性のブタ由来（左）およびウシ由来（右）の光架橋型LunaGel™ ECMについて、架橋時間に対するせん断貯蔵弾性率（G’）の変化を示している。測定は、試験開始後最初の2分間は光を照射せずに実施された。その後、ElastoSens™ Bio装置により2分時点で照明が点灯するよう設定され、この時点以降から12分（照明が消灯した時点）にかけてG’が増加する様子が明確に観察された。ゲルの最終的な粘弾性特性を特定するため、測定は約15分間継続された。試験終了後、試料は均一に架橋されていた（図2）。

図。 1: ブタ由来（左）およびウシ由来（右）のLunaGel™ ECM製品における、時間の関数としてのせん断貯蔵弾性率（G’、Pa）。

図。 2: 試験後のLunaGel™サンプルの代表的な例。

高剛性ハイドロゲルでは露光開始から約0.5分後、低剛性ハイドロゲルでは約1.5分後に光架橋が始まった（図3）。最終的な G’ は、高剛性製剤の方が低剛性製剤に比べて約 8 倍高かった。低剛性製剤は G’ が約 550 Pa の柔らかいゲルを形成したのに対し、高剛性ハイドロゲルは約 4,500 Pa に達し、ブタ由来とウシ由来の間には統計的な差異は認められなかった。しかし、どちらのゼラチンタイプにおいても、低剛性製剤と高剛性製剤の間には有意な差が認められた。実際、低剛性および高剛性のLunaGel™製品には、幅広い剛性範囲を精密に制御できるよう、異なる濃度の変性ゼラチン成分が含まれている。最終的なtan(δ)は常に0.1未満であり、これらのハイドロゲルにおいては、粘性挙動（せん断損失弾性率G’’に関連）よりも弾性挙動（せん断貯蔵弾性率G’’に関連）がはるかに支配的であることを示している。

図。 3: 光架橋ゲルの初期架橋時間（分）、最終G’（Pa）、および最終tan(δ)。

低剛性および高剛性のいずれの配合においても、光照射時間を調整することで、最終的なG’以下となる所望の目標剛性を達成することができる。図4は、9.0 mW/cm²の光強度でそれぞれ2分、4分、8分、10分間光照射して架橋させた高剛性ブタ由来LunaGel™の、時間に対するせん断貯蔵弾性率（G’、Pa）の変化を示している。同様に、前述の照射時間について、試験開始から 2 分後に光が点灯するようにプログラムした。予想通り、最初の 4 分間は曲線がほぼ同じであった。この時点以降、より長い光照射を受けた試料では、G’ は時間の経過とともに大幅に増加し続けた。

図。 4: 405 nmの光（9.0 mW/cm²）を用いて2、4、8、および10分間架橋処理した高剛性ブタ由来LunaGel™の、時間の関数としてのせん断貯蔵弾性率（G’、Pa）。

LunaGel ECMの剛性が乳がん細胞の挙動に及ぼす影響を調べるため、MDA-MB-231スフェロイドを、せん断貯蔵弾性率（G’）がそれぞれ約110、220、440 kPaのECM上に播種した。 7日間の培養後、ECMの剛性の違いによって細胞形態に著しい差異が認められた（図5）。乳がん細胞の浸潤性は ECM の剛性に応じて増加し、組織の剛性が高い乳がんでは転移が優先的に発生するという臨床データを裏付ける結果となった。LunaGel ECM の剛性が高くなるにつれて、転移に関連する移動性の高い細胞形態への変化（図 5、拡大図）が観察された。

図。 5: 乳がん細胞の浸潤性は、ECMの剛性が高まるにつれて増加する。画像は、せん断貯蔵弾性率が（A）110 Pa、（B）220 Pa、および（C）440 PaのLunaGelウシゼラチンECM上に播種されたMDA-MB-231スフェロイドを、7日間の培養後に撮影したものである。細胞／スフェロイドは、細胞核（青）、β1-インテグリン（緑）、細胞膜（オレンジ）、アクチン（マゼンタ）について染色された。

結論

Gelomics社のLunaGel™ ECM製品における光架橋中の粘弾性変化を、ElastoSens™ Bioを用いてリアルタイムで正確に捉えることに成功した。最終的なG’値は、低剛性製剤と比較して高剛性製剤で約8倍高かった。これらのハイドロゲルの最終的な粘弾性特性は、架橋（405 nm）中の光照射時間を変化させることで容易に調整できました。乳がん細胞の浸潤性はECMの剛性が高くなるにつれて著しく増加し、LunaGel™システムが生理的および病理生理学的組織状態を忠実に再現できることが実証されました。

概要

LunaGel™製品は、所望の剛性を備えたハイドロゲルの開発を容易にします。
ElastoSens™ Bioは、ハイドロゲルの粘弾性測定中に（さまざまな波長の）光を照射することができ、その光架橋の動態をリアルタイムで把握することができます。
ElastoSens™ Bioでは、ハイドロゲルの光架橋時の光強度と露光時間を容易に組み合わせることで、特定の用途に合わせた目標の粘弾性を実現することができます。
LunaGel™ ECMは、ECMの剛性に応じた細胞の挙動の研究を容易にします。

参考文献

[1] Keely, P., & Nain, A. (2015). Capturing relevant extracellular matrices for investigating cell migration. F1000Research, 4.

[2] Wei, S. C., Fattet, L., Tsai, J. H., Guo, Y., Pai, V. H., Majeski, H. E., … & Yang, J. (2015). Matrix stiffness drives epithelial–mesenchymal transition and tumour metastasis through a TWIST1–G3BP2 mechanotransduction pathway. Nature cell biology, 17(5), 678-688.

[3] Paszek, M. J., Zahir, N., Johnson, K. R., Lakins, J. N., Rozenberg, G. I., Gefen, A., … & Weaver, V. M. (2005). Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell, 8(3), 241-254.

[4] Caliari, S. R., & Burdick, J. A. (2016). A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature methods, 13(5), 405-414.

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ECMハイドロゲルの剛性の調整

人体のすべての細胞は、細胞機能や組織の発達を調節する機械的力にさらされており、各細胞の種類は、それらが存在する組織の機械的特性に特異的に適応しています。また、ヒト組織のマトリックス特性は疾患によって変化することもあり、それがひいては疾患の進行を促進することもあります。