Anwendungshinweis | ElastoSens™ Bio
Anpassung der Steifigkeit von ECM-Hydrogelen mit ElastoSens™ Bio
In Zusammenarbeit mit
Hinweis
Diese Studie entstand in Zusammenarbeit zwischen Rheolution (QC, Kanada) und Gelomics (QLD, Australien).
von Gloria Pinilla, M.Sc., Senior Application Specialist für, Rheolution Inc.
Zusammenfassung
- Die anfängliche Steifigkeit von 3D-Kultursystemen lässt sich variieren, um physiologische und pathologische Prozesse in vitro zu untersuchen.
- Photochemisch vernetzbare Hydrogele eignen sich hervorragend für 3D-Kultursysteme, da sie der natürlichen extrazellulären Matrix ähneln und sich ihre endgültige Steifigkeit leicht steuern lässt.
- Die LunaGel™-Produkte der extrazellulären Matrix von Gelomics wurden erfolgreich mit sichtbarem Licht photovernetzt, und ihre Vernetzungsdynamik wurde in Echtzeit im ElastoSens™ Bio gemessen.
- Die Photokreuzvernetzungsreaktionen verliefen sowohl bei den LunaGel™-Kits mit niedriger als auch mit hoher Steifigkeit zügig.
- Die LunaGel™-Kits mit hoher Steifigkeit wiesen eine höhere Steifigkeit auf als die Kits mit niedriger Steifigkeit.
- Die Steifigkeit der LunaGel™-Matrizen nahm mit zunehmender Dauer der Photoverknetung zu.
- Die Invasivität von Brustkrebszellen nahm mit zunehmender Steifigkeit der extrazellulären Matrix deutlich zu.
Die Rolle der Hydrogel-Steifigkeit für das Zellverhalten
Einleitung
Alle Zellen im menschlichen Körper sind mechanischen Kräften ausgesetzt, die die Zellfunktion und die Gewebeentwicklung regulieren, und jeder Zelltyp ist spezifisch an die mechanischen Eigenschaften des Gewebes angepasst, in dem er sich befindet. Die Matrixeigenschaften menschlicher Gewebe können sich zudem im Krankheitsverlauf verändern und wiederum das Fortschreiten der Erkrankung begünstigen. So werden beispielsweise das Wachstum, das Überleben, die Differenzierung und die Morphogenese normaler Brust-Epithelzellen durch die Interaktion mit einer weichen Matrix, die der Steifigkeit von normalem Brustgewebe ähnelt, maßgeblich unterstützt. Nach einer Transformation im Rahmen von Brustkrebs wird das Gewebe jedoch zunehmend steifer [1], und die Tumorzellen werden deutlich kontraktiler und reagieren übermäßig stark auf mechanische Signale der Matrix, was letztendlich die epitheliale-mesenchymale Transition (EMT) und die Metastasierung vorantreibt [2,3]. Die mechanistische Untersuchung des komplexen Zusammenspiels zwischen Substrateigenschaften und zellulärem Verhalten erfordert fortschrittliche Zellkulturmethoden, die die mit herkömmlichen Kulturansätzen verbundenen Einschränkungen überwinden [4].
Die LunaGel™-Extrazellulären Matrizen (ECMs) von Gelomics sind photochemisch vernetzbare Hydrogele, die ein kontrolliertes 3D-Zellkultursystem zur Untersuchung pathologischer und physiologischer Prozesse in vitro bieten. Basierend auf ECM-Komponenten wie Kollagen Typ I, III, IV und V sowie Bindegewebsglykoproteinen und Proteoglykanen ahmen diese ECMs die natürliche extrazelluläre Matrix (ECM), die die Zellen im menschlichen Körper umgibt, sehr genau nach und fördern die Zelladhäsion, Proliferation, Differenzierung, Migration sowie den proteolytischen Abbau der ECM. Darüber hinaus ermöglicht der photochemische Vernetzungsprozess Wissenschaftlern eine bessere Kontrolle über die endgültige Steifigkeit. Durch einfache Variation der Vernetzungsdauer lässt sich die Gel-Steifigkeit feinabstimmen, um weiche und harte Gewebe wie beispielsweise Gehirn, Leber, Brustgewebe und Knorpel sowohl im gesunden als auch im erkrankten Zustand nachzubilden. Aus diesen Gründen sind sie ideale Substrate für die Kultivierung und Differenzierung einer Vielzahl von Zelltypen und erleichtern die Untersuchung von durch die Matrixsteifigkeit induzierten Veränderungen des Zellverhaltens.
ElastoSens™ Bio misst berührungslos die viskoelastischen Eigenschaften weicher Materialien. Durch die Einwirkung sanfter Schwingungen auf die Probe ist das Gerät in der Lage, die Photokreuzvernetzungskinetik bei der gewünschten Wellenlänge aufzuzeichnen. In diesem Anwendungsbericht wurden LunaGel™-ECMs auf Basis von chemisch modifizierter Schweinehaut- und Rinderknochen-Gelatine photochemisch vernetzt, während ihre Vernetzungskinetik in Echtzeit mit dem ElastoSens™ Bio erfasst wurde. Um die Eignung von LunaGel™-ECMs zur Nachbildung pathophysiologischer Veränderungen der Gewebesteifigkeit und deren Auswirkungen auf das Fortschreiten von Krebs zu untersuchen, wurden Brustkrebs-Sphäroide auf Substraten unterschiedlicher Steifigkeit kultiviert und deren Morphologien beobachtet.
Photochemische Vernetzung von LunaGel™-Hydrogelen mittels Gelomics
Materialien und Methoden
LunaGel™-ECMs auf Basis von chemisch modifizierter Schweinehautgelatine, Typ A (LunaGel™ – Schweinehautgelatine – niedrige und hohe Steifigkeit, Gelomics) und Rinderknochen-Gelatine, Typ B (LunaGel™ – Rinderknochen-Gelatine – niedrige und hohe Steifigkeit, Gelomics) wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt. Kurz gesagt wurden die Photoinitiator-Fläschchen in PBS aufgelöst und bei 37 °C mit den photokreuzvernetzbaren ECM-Lösungen vermischt. 2 ml der Produkte wurden in den Probenhalter des ElastoSens™ Bio pipettiert, und die Viskoelastizitätsprüfung wurde unverzüglich bei 37 °C unter Verwendung der folgenden Messsequenzen gestartet:
Der Schubmodul (G’) und tan(δ) wurden direkt vom ElastoSens™ Bio ermittelt. Die anfängliche Vernetzungszeit wurde anhand des Schnittpunkts von G’ und G’’ (tan(δ) = 1) bestimmt.
Die Steifigkeit des Hydrogels beeinflusst das Zellverhalten
Ergebnisse und Diskussion
Die photochemisch vernetzbaren LunaGel™-ECMs wurden zunächst hinsichtlich ihrer viskoelastischen Eigenschaften untersucht, die sich anhand des Scherspeichermoduls (G’ – elastischer Anteil des viskoelastischen Verhaltens) und des Scherverlustmoduls (G’’ – viskoser Anteil des viskoelastischen Verhaltens) beschreiben lassen. Das Verhältnis zwischen G’’ und G’ (Dämpfungsfaktor oder tan(δ)) wird in der Regel ebenfalls bestimmt, um aufzuzeigen, welcher Anteil überwiegt.
Abb. 1 zeigt die Entwicklung des Scherspeichermoduls (G’) in Abhängigkeit von der Vernetzungszeit für photokreuzvernetzbare LunaGel™-ECMs mit niedriger und hoher Steifigkeit aus Schweine- (links) und Rindergewebe (rechts). Die Messungen wurden während der ersten 2 Minuten des Tests ohne Lichteinwirkung durchgeführt. Anschließend wurde das Licht so programmiert, dass es vom ElastoSens™ Bio-Gerät nach 2 Minuten eingeschaltet wurde, und dessen Wirkung ließ sich deutlich an dem Anstieg von G’ nach diesem Zeitpunkt bis zur 12. Minute (als das Licht ausgeschaltet wurde) beobachten. Die Messungen wurden etwa 15 Minuten lang fortgesetzt, um die endgültigen viskoelastischen Eigenschaften des Gels zu ermitteln. Die Proben waren nach dem Test homogen vernetzt (Abb. 2).
Abb. 1: Schubmodul (G’, Pa) als Funktion der Zeit für die LunaGel™-ECM-Produkte aus Schweine- (links) und Rindergewebe (rechts).
Abb. 2: Repräsentatives Beispiel einer LunaGel™-Probe nach der Prüfung.
Die photochemische Vernetzung setzte bei den Hydrogelen mit hoher Steifigkeit nach etwa 0,5 Minuten Belichtung und bei denen mit niedriger Steifigkeit nach etwa 1,5 Minuten ein (Abb. 3). Der Endwert von G’ war bei den Formulierungen mit hoher Steifigkeit etwa achtmal höher als bei den Formulierungen mit niedriger Steifigkeit. Formulierungen mit niedriger Steifigkeit bildeten weiche Gele mit einem G’-Wert von ~ 550 Pa, während Hydrogele mit hoher Steifigkeit ~ 4 500 Pa erreichten; dabei wurde kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen Schweine- und Rinderquellen festgestellt. Bei beiden Gelatinearten wurden jedoch signifikante Unterschiede zwischen den Formulierungen mit niedriger und hoher Steifigkeit beobachtet. Tatsächlich enthalten LunaGel™-Produkte mit niedriger und hoher Steifigkeit unterschiedliche Konzentrationen der modifizierten Gelatinekomponenten, um eine präzise Steuerung über einen weiten Steifigkeitsbereich zu ermöglichen. Der endgültige tan(δ)-Wert lag stets unter 0,1, was zeigt, dass das elastische Verhalten (bezogen auf den Schubspeichermodul, G’’) in diesen Hydrogelen deutlich stärker ausgeprägt ist als das viskose Verhalten (bezogen auf den Schubverlustmodul, G’’).
Abb. 3: Anfängliche Vernetzungszeit (min), Endwert von G’ (Pa) und Endwert von tan(δ) der photochemisch vernetzten Gele.
Sowohl bei Formulierungen mit geringer als auch mit hoher Steifigkeit kann die Dauer der Lichteinwirkung variiert werden, um die gewünschten Zielsteifigkeiten zu erreichen, die kleiner oder gleich dem endgültigen G’ sind. Abb. 4 zeigt den zeitlichen Verlauf des Scherspeichermoduls (G’, Pa) für das hochsteife LunaGel™ aus Schweinegewebe, das jeweils 2, 4, 8 und 10 Minuten lang mit 9,0 mW/cm² vernetzt wurde. Ebenso wurde das Licht so programmiert, dass es nach 2 Minuten Testdauer mit der genannten Bestrahlungsdauer eingeschaltet wurde. Wie erwartet verliefen die Kurven in den ersten 4 Minuten nahezu identisch. Nach diesem Zeitpunkt stieg der G’-Wert bei den Proben mit längerer Lichtbestrahlung im Laufe der Zeit weiterhin deutlich an.
Abb. 4: Scherspeichermodul (G’, Pa) als Funktion der Zeit für das hochsteife LunaGel™ aus Schweinegewebe, das 2, 4, 8 und 10 Minuten lang mit 405-nm-Licht (9,0 mW/cm²) vernetzt wurde.
Um die Auswirkungen der Steifigkeit der LunaGel-ECM auf das Verhalten von Brustkrebszellen zu untersuchen, wurden MDA-MB-231-Sphäroide auf ECMs mit einem Scherspeichermodul (G’) von ~ 110, 220 bzw. 440 kPa ausgesät. Nach 7 Tagen Kultivierung wurden erhebliche Unterschiede in der Zellmorphologie zwischen den verschiedenen ECM-Steifigkeiten beobachtet (Abb. 5). Die Invasivität der Brustkrebszellen nahm in Abhängigkeit von der ECM-Steifigkeit zu, was klinische Daten bestätigt, die auf ein bevorzugtes Auftreten von Metastasen bei Brustkrebs mit höherer Gewebesteifigkeit hindeuten. Mit zunehmender Steifigkeit der LunaGel-ECM wurde eine Verlagerung hin zu migrationsfähigeren Zellmorphologien beobachtet, die mit Metastasen assoziiert sind (Abb. 5, vergrößerte Einsätze).
Abb. 5: Die Invasivität von Brustkrebszellen nimmt mit zunehmender Steifigkeit der extrazellulären Matrix (ECM) zu. Die Abbildungen zeigen MDA-MB-231-Sphäroide, die auf LunaGel-Rindergelatine-ECMs mit einem Scherspeichermodul von (A) 110 Pa, (B) 220 Pa bzw. (C) 440 Pa ausgesät wurden, nach 7 Tagen Kultivierung. Die Zellen/Sphäroide wurden auf Zellkerne (blau), β1-Integrin (grün), Zellmembran (orange) und Aktin (magenta) angefärbt.
Schlussfolgerungen
Die viskoelastische Entwicklung der LunaGel™-ECM-Produkte von Gelomics während der Photoverknetung konnte mithilfe von ElastoSens™ Bio erfolgreich in Echtzeit erfasst werden. Der Endwert von G’ war bei den Formulierungen mit hoher Steifigkeit etwa achtmal höher als bei denen mit niedriger Steifigkeit. Die endgültigen viskoelastischen Eigenschaften dieser Hydrogele ließen sich durch Variation der Belichtungszeit während der Vernetzung (405 nm) problemlos anpassen. Die Invasivität der Brustkrebszellen nahm mit zunehmender ECM-Steifigkeit signifikant zu, was die Fähigkeit des LunaGel™-Systems belegt, physiologische und pathophysiologische Gewebebedingungen realitätsnah nachzubilden.
Zusammenfassung
- LunaGel™-Produkte erleichtern die Entwicklung von Hydrogelen mit der gewünschten Steifigkeit.
- ElastoSens™ Bio ist in der Lage, während der Messung der Viskoelastizität von Hydrogelen Licht (bei verschiedenen Wellenlängen) einzustrahlen und so deren Photokreuzvernetzungskinetik in Echtzeit zu erfassen.
- Die Lichtintensitäten und Belichtungszeiten während der photochemischen Vernetzung von Hydrogelen lassen sich im ElastoSens™ Bio problemlos kombinieren, um die für die jeweilige Anwendung angestrebte Viskoelastizität zu erreichen.
- LunaGel™-ECMs erleichtern die Untersuchung des Zellverhaltens in Abhängigkeit von der Steifigkeit der extrazellulären Matrix (ECM).
Literaturverzeichnis
[1] Keely, P., & Nain, A. (2015). Capturing relevant extracellular matrices for investigating cell migration. F1000Research, 4.
[2] Wei, S. C., Fattet, L., Tsai, J. H., Guo, Y., Pai, V. H., Majeski, H. E., … & Yang, J. (2015). Matrix stiffness drives epithelial–mesenchymal transition and tumour metastasis through a TWIST1–G3BP2 mechanotransduction pathway. Nature cell biology, 17(5), 678-688.
[3] Paszek, M. J., Zahir, N., Johnson, K. R., Lakins, J. N., Rozenberg, G. I., Gefen, A., … & Weaver, V. M. (2005). Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell, 8(3), 241-254.
[4] Caliari, S. R., & Burdick, J. A. (2016). A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature methods, 13(5), 405-414.
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