Nota applicativa | ElastoSens™ Bio
Regolazione della rigidità degli idrogel ECM con ElastoSens™ Bio
In collaborazione con
Avviso
Questo studio è stato realizzato in collaborazione tra Rheolution (QC, Canada) e Gelomics (QLD, Australia).
di Gloria Pinilla, M.Sc., Specialista senior per le applicazioni,
Rheolution Inc.
Sintesi
- La rigidità iniziale dei sistemi di coltura 3D può essere modificata per studiare i processi fisiologici e patologici in vitro.
- Gli idrogel fotocrosslinkabili sono ottimi candidati per i sistemi di coltura 3D grazie alla loro somiglianza con la matrice extracellulare naturale e alla facilità con cui si può regolare la loro rigidità finale.
- I prodotti LunaGel™ a matrice extracellulare di Gelomics sono stati reticolati con successo tramite luce visibile e la loro cinetica di reticolazione è stata misurata in tempo reale con ElastoSens™ Bio.
- Le reazioni di fotoreticolazione si sono svolte rapidamente sia nel kit LunaGel™ a bassa rigidità che in quello ad alta rigidità.
- I kit LunaGel™ ad alta rigidità hanno mostrato una rigidità maggiore rispetto a quelli a bassa rigidità.
- La rigidità delle matrici LunaGel™ è aumentata con l’aumentare della durata della reticolazione fotochimica.
- L’invasività delle cellule tumorali al seno è aumentata in modo significativo con l’aumentare della rigidità della matrice extracellulare (ECM).
Il ruolo della rigidità dell'idrogel nel comportamento delle cellule
Introduzione
Tutte le cellule del corpo umano sono esposte a forze meccaniche che regolano la loro funzione e lo sviluppo dei tessuti, e ogni tipo di cellula si adatta in modo specifico alle proprietà meccaniche del tessuto in cui si trova. Le proprietà della matrice dei tessuti umani possono anche cambiare in presenza di una malattia e, a loro volta, favorirne la progressione. Ad esempio, la crescita, la sopravvivenza, la differenziazione e la morfogenesi delle cellule epiteliali mammarie normali sono ben supportate dall’interazione con una matrice morbida, simile alla rigidità del tessuto mammario sano. A seguito della trasformazione che si verifica nel cancro al seno, però, il tessuto diventa progressivamente più rigido [1] e le cellule tumorali diventano significativamente più contrattili e iper-reattive agli stimoli meccanici della matrice, favorendo in ultima analisi la transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) e le metastasi [2,3]. Lo studio dei meccanismi alla base della complessa interazione tra le proprietà del substrato e il comportamento cellulare richiede metodologie avanzate di coltura cellulare in grado di superare i limiti associati agli approcci tradizionali [4].
Le matrici extracellulari (ECM) LunaGel™ di Gelomics sono idrogel fotoreticolabili che offrono un sistema di coltura cellulare 3D controllato per studiare i processi patologici e fisiologici in vitro. Basate su componenti delle ECM come il collagene di tipo I, III, IV e V, oltre che sulle glicoproteine e sui proteoglicani del tessuto connettivo, queste ECM riproducono fedelmente la matrice extracellulare naturale (ECM) che circonda le cellule nel corpo umano e facilitano l’adesione, la proliferazione, la differenziazione, la migrazione delle cellule e la degradazione proteolitica dell’ECM. Inoltre, il processo di reticolazione fotoindotta permette agli scienziati di avere un maggiore controllo sulla rigidità finale. Basta variare la durata della reticolazione per regolare con precisione la rigidità del gel, in modo da riprodurre tessuti morbidi e duri come il cervello, il fegato, il seno, la cartilagine e altri, sia in condizioni sane che patologiche. Per questi motivi, sono substrati ideali per la coltura e la differenziazione di un’ampia gamma di tipi cellulari e facilitano lo studio dei cambiamenti nel comportamento cellulare indotti dalla rigidità della matrice.
ElastoSens™ Bio misura senza contatto le proprietà viscoelastiche dei materiali morbidi. Applicando lievi vibrazioni al campione, lo strumento è in grado di registrare la cinetica di fotoreticolazione alla lunghezza d’onda desiderata. In questa nota applicativa, gli ECM LunaGel™ a base di pelle suina modificata chimicamente e gelatina di ossa bovine sono stati entrambi sottoposti a fotoreticolazione, mentre la loro cinetica di reticolazione è stata valutata in tempo reale con ElastoSens™ Bio. Per verificare se le ECM LunaGel™ fossero adatte a riprodurre i cambiamenti fisiopatologici nella rigidità dei tessuti e i relativi effetti sulla progressione del cancro, sono stati coltivati sferoidi di cancro al seno su substrati di diversa rigidità e ne sono state osservate le morfologie.
Fotoreticolazione degli idrogel LunaGel™ con la tecnologia Gelomics
Materiali e metodi
Gli ECM LunaGel™ a base di gelatina di pelle suina modificata chimicamente, tipo A (LunaGel™ – Gelatina di pelle suina – bassa e alta rigidità, Gelomics) e gelatina di osso bovino, tipo B (LunaGel™ – Gelatina di osso bovino – bassa e alta rigidità, Gelomics) sono stati preparati seguendo le istruzioni del produttore. In breve, le fiale di fotoiniziatore sono state sciolte in PBS e mescolate con le soluzioni di ECM fotoreticolabili a 37 °C. Sono stati pipettati 2 mL dei prodotti nel portacampioni dell’ElastoSens™ Bio e il test di viscoelasticità è stato avviato immediatamente a 37 °C utilizzando le seguenti sequenze di misurazione:
Il modulo elastico di taglio (G’) e tan(δ) sono stati ricavati direttamente dall’ElastoSens™ Bio. Il tempo iniziale di reticolazione è stato determinato in base all’intersezione tra G’ e G’’ (tan(δ) = 1).
La rigidità dell'idrogel influenza il comportamento delle cellule
Risultati e discussione
Gli ECM LunaGel™ fotocrosslinkabili sono stati innanzitutto valutati in termini di proprietà viscoelastiche, che possono essere descritte dal modulo di immagazzinamento al taglio (G’ – parte elastica del comportamento viscoelastico) e dal modulo di perdita al taglio (G’’ – parte viscosa del comportamento viscoelastico). Di solito si calcola anche il rapporto tra G’’ e G’ (fattore di smorzamento o tan(δ)) per capire quale comportamento sia predominante.
La fig. 1 mostra l’evoluzione del modulo di conservazione al taglio (G’) in funzione del tempo di reticolazione per le ECM LunaGel™ fotocrosslinkabili a bassa e alta rigidità, di origine suina (a sinistra) e bovina (a destra). Le misurazioni sono state effettuate senza esposizione alla luce durante i primi 2 minuti del test. La luce è stata poi programmata per essere accesa dallo strumento ElastoSens™ Bio dopo 2 minuti e il suo effetto è stato chiaramente osservato con l’aumento di G’ dopo questo momento fino a 12 minuti (quando la luce è stata spenta). Le misurazioni sono proseguite per circa 15 minuti per determinare le proprietà viscoelastiche finali del gel. I campioni risultavano reticolati in modo omogeneo al termine del test (Fig. 2).
Fig. 1: Modulo di conservazione al taglio (G’, Pa) in funzione del tempo per i prodotti ECM LunaGel™ suini (a sinistra) e bovini (a destra).
Fig. 2: Esempio rappresentativo di un campione di LunaGel™ dopo il test.
La reticolazione fotoindotta è iniziata dopo circa 0,5 min di esposizione alla luce per gli idrogel ad alta rigidità e dopo circa 1,5 min per quelli a bassa rigidità (Fig. 3). Il valore finale di G’ era circa 8 volte più alto per le formulazioni ad alta rigidità rispetto a quelle a bassa rigidità. Le formulazioni a bassa rigidità hanno formato gel morbidi con un G’ di ~ 550 Pa, mentre gli idrogel ad alta rigidità hanno raggiunto ~ 4 500 Pa e non è stata riscontrata alcuna differenza statistica tra le fonti suine e quelle bovine. Tuttavia, sono state osservate differenze significative tra le formulazioni a bassa e alta rigidità per entrambi i tipi di gelatina. Infatti, i prodotti LunaGel™ a bassa e alta rigidità contengono concentrazioni diverse dei componenti della gelatina modificata per consentire un controllo preciso su un ampio intervallo di rigidità. Il valore finale di tan(δ) è risultato sempre inferiore a 0,1, a dimostrazione del fatto che in questi idrogel il comportamento elastico (correlato al modulo di accumulo di taglio, G’’) è molto più predominante rispetto al comportamento viscoso (correlato al modulo di perdita di taglio, G’’).
Fig. 3: Tempo iniziale di reticolazione (min), G’ finale (Pa) e tan(δ) finale dei gel fotoreticolati.
Sia per le formulazioni a bassa che ad alta rigidità, la durata dell’esposizione alla luce può essere variata per raggiungere i valori di rigidità desiderati, inferiori o uguali al valore finale di G’. La Fig. 4 mostra l’andamento del modulo di immagazzinamento di taglio (G’, Pa) in funzione del tempo per il LunaGel™ suino ad alta rigidità reticolato con 9,0 mW/cm² per 2, 4, 8 e 10 minuti, rispettivamente. Allo stesso modo, la luce è stata programmata per accendersi dopo 2 minuti di prova con la durata indicata. Come previsto, le curve erano quasi identiche durante i primi 4 minuti. Dopo questo intervallo di tempo, il G’ ha continuato ad aumentare in modo sostanziale nel tempo per i campioni sottoposti a un’esposizione alla luce più lunga.
Fig. 4: Modulo di conservazione al taglio (G’, Pa) in funzione del tempo per il LunaGel™ suino ad alta rigidità reticolato con luce a 405 nm (9,0 mW/cm²) per 2, 4, 8 e 10 minuti.
Per studiare gli effetti della rigidità della MEC di LunaGel sul comportamento delle cellule tumorali al seno, gli sferoidi MDA-MB-231 sono stati seminati su MEC con modulo di conservazione al taglio (G’) pari rispettivamente a circa 110, 220 e 440 kPa. Dopo 7 giorni di coltura, sono state osservate differenze significative nelle morfologie cellulari tra le diverse rigidità dell’ECM (Fig. 5). L’invasività delle cellule tumorali al seno è aumentata in funzione della rigidità dell’ECM, confermando i dati clinici che suggeriscono una maggiore incidenza di metastasi nel cancro al seno con tessuti più rigidi. Con l’aumentare della rigidità dell’ECM di LunaGel, si è osservato uno spostamento verso morfologie cellulari più migratorie, associate alle metastasi (Fig. 5, inserti ingranditi).
Fig. 5: L’invasività delle cellule tumorali al seno aumenta con l’aumentare della rigidità della matrice extracellulare (ECM). Le immagini mostrano sferoidi MDA-MB-231 seminati su ECM di gelatina bovina LunaGel con modulo di stoccaggio di taglio pari rispettivamente a (A) 110 Pa, (B) 220 Pa e (C) 440 Pa, dopo 7 giorni di coltura. Le cellule/gli sferoidi sono stati colorati per evidenziare i nuclei cellulari (blu), l’integrina β1 (verde), la membrana cellulare (arancione) e l’actina (magenta).
Conclusioni
L’evoluzione viscoelastica dei prodotti ECM LunaGel™ di Gelomics durante la reticolazione fotochimica è stata monitorata con successo in tempo reale utilizzando ElastoSens™ Bio. Il valore finale di G’ era circa 8 volte superiore nelle formulazioni ad alta rigidità rispetto a quelle a bassa rigidità. Le proprietà viscoelastiche finali di questi idrogel sono state facilmente regolate variando il tempo di esposizione alla luce durante la reticolazione (405 nm). L’invasività delle cellule tumorali al seno è aumentata significativamente con l’aumentare della rigidità dell’ECM, dimostrando la capacità del sistema LunaGel™ di riprodurre fedelmente le condizioni fisiologiche e fisiopatologiche dei tessuti.
Sintesi
- I prodotti LunaGel™ permettono di ottenere idrogel con la rigidità desiderata.
- ElastoSens™ Bio è in grado di applicare luce (a diverse lunghezze d’onda) durante la misurazione della viscoelasticità degli idrogel, fornendo in tempo reale i dati relativi alla cinetica della loro fotoreticolazione.
- Con ElastoSens™ Bio è possibile combinare facilmente le intensità luminose e i tempi di esposizione durante il fotocrosslinking degli idrogel, per ottenere la viscoelasticità desiderata per l’applicazione specifica.
- Gli ECM LunaGel™ permettono di studiare il comportamento delle cellule in funzione della rigidità dell’ECM.
Riferimenti
[1] Keely, P., & Nain, A. (2015). Capturing relevant extracellular matrices for investigating cell migration. F1000Research, 4.
[2] Wei, S. C., Fattet, L., Tsai, J. H., Guo, Y., Pai, V. H., Majeski, H. E., … & Yang, J. (2015). Matrix stiffness drives epithelial–mesenchymal transition and tumour metastasis through a TWIST1–G3BP2 mechanotransduction pathway. Nature cell biology, 17(5), 678-688.
[3] Paszek, M. J., Zahir, N., Johnson, K. R., Lakins, J. N., Rozenberg, G. I., Gefen, A., … & Weaver, V. M. (2005). Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell, 8(3), 241-254.
[4] Caliari, S. R., & Burdick, J. A. (2016). A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature methods, 13(5), 405-414.
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