应用说明 | ElastoSens™ Bio
利用 ElastoSens™ Bio 调节 ECM 水凝胶的刚度
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本研究是由Rheolution（加拿大魁北克省）与Gelomics（澳大利亚昆士兰州）共同合作完成的。
by Gloria Pinilla, M.Sc.
Rheolution Inc. 高级应用专家。
摘要
- 可以通过调节3D培养系统的初始刚度，在体外研究生理和病理过程。
- 光交联水凝胶因其与天然细胞外基质的相似性以及易于控制最终刚度，是三维培养系统的理想选择。
- Gelomics公司的LunaGel™细胞外基质产品已成功通过可见光进行光交联，并在ElastoSens™ Bio设备中对其交联动力学进行了实时测量。
- 无论是在低刚度还是高刚度的LunaGel™试剂盒中，光交联反应都迅速发生。
- 高刚度LunaGel™试剂盒的刚度高于低刚度试剂盒。
- LunaGel™基质的刚度随光交联时间的延长而增加。
- 随着细胞外基质（ECM）硬度的增加，乳腺癌细胞的侵袭性显著增强。
水凝胶刚度在细胞行为中的作用
引言
人体内的所有细胞都会受到机械力的作用，这些力调节着细胞功能和组织发育，而每种细胞类型都会根据其所处组织的力学特性进行特异性适应。人体组织的基质特性也会随疾病发生而改变，进而促进疾病的进展。 例如，正常乳腺上皮细胞的生长、存活、分化和形态发生，在与一种软基质的相互作用下得到有力支持，该基质的刚度与正常乳腺组织相似。 然而，在乳腺癌发生转化后，组织会逐渐变硬 [1]，肿瘤细胞的收缩性显著增强，并对基质的机械信号反应过度，最终导致上皮-间质转化（EMT）和转移 [2,3]。 要研究基质特性与细胞行为之间复杂的相互作用机制，需要采用先进的细胞培养方法，以克服传统培养方法的局限性 [4]。
Gelomics LunaGel™ 细胞外基质（ECM）是一种光交联水凝胶，可提供受控的 3D 细胞培养系统，用于体外研究病理和生理过程。 这些细胞外基质以 I 型、III 型、IV 型和 V 型胶原蛋白以及结缔组织糖蛋白和蛋白聚糖等成分为基础，能够高度模拟人体内细胞周围的天然细胞外基质（ECM），并促进细胞的附着、增殖、分化、迁移以及对细胞外基质的蛋白水解降解。 此外，光交联过程使科学家能够更好地控制最终的刚度。只需改变交联时间，即可对凝胶刚度进行微调，以模拟健康和病变状态下的大脑、肝脏、乳腺、软骨等软硬组织。 正因如此，它们是培养和分化多种细胞类型的理想基质，并有助于研究基质刚度对细胞行为产生的诱导性改变。
ElastoSens™ Bio可非接触式测量软材料的粘弹性特性。通过对样品施加轻微振动，该仪器能够记录特定波长下的光交联动力学过程。 在本应用说明中，基于化学修饰的猪皮明胶和牛骨明胶制备的 LunaGel™ ECM 均进行了光交联，同时在ElastoSens™ Bio 仪器中对其交联动力学进行了实时评估。 为了研究 LunaGel™ ECM 是否适合模拟组织刚度的病理生理变化及其对癌症进展的影响，将乳腺癌球体培养在刚度各异的基质上，并观察了其形态。
通过Gelomics技术对LunaGel™水凝胶进行光交联
材料与方法
基于化学修饰的A型猪皮明胶（LunaGel™ – 猪皮明胶 – 低刚度与高刚度，Gelomics）和B型牛骨明胶（LunaGel™ – 牛骨明胶 – 低刚度与高刚度， Gelomics）制备的LunaGel™ ECMs，均按照制造商的说明进行制备。 简而言之，将光引发剂小瓶中的内容物溶解于PBS中，并在37 °C下与光交联型ECM溶液混合。用移液管将2 mL制备好的样品吸入ElastoSens™ Bio的样品架中，随即在37 °C下开始进行粘弹性测试，测量顺序如下：
剪切弹性模量（G’）和tan(δ)直接由ElastoSens™ Bio测得。初始交联时间根据G’与G’’的交叉点（tan(δ) = 1）确定。
水凝胶的刚度会影响细胞的行为
结果与讨论
首先对光交联型 LunaGel™ 细胞外基质（ECMs）的粘弹性性能进行了评估，这些性能可通过剪切储能模量（G’——粘弹性行为中的弹性部分）和剪切损耗模量（G’’——粘弹性行为中的粘性部分）来描述。 通常还会测定 G’’ 与 G’ 之间的比值（阻尼因子或 tan(δ)），以表明哪种行为占主导地位。
图1显示了低刚度和高刚度猪源（左）及牛源（右）光交联型LunaGel™细胞外基质（ECM）的剪切储能模量（G’）随交联时间的变化趋势。测试开始后的前2分钟内，测量过程未进行光照。 随后，通过ElastoSens™ Bio仪器将光源设定为在2分钟时开启，并清晰观察到其影响：自该时间点起直至12分钟（此时光源关闭），G’值持续上升。 测量持续了约15分钟，以确定凝胶的最终粘弹性性能。测试结束后，样品均已均匀交联（图2）。
图。 1: 猪源（左）和牛源（右）LunaGel™ ECM 产品的剪切储能模量（G’，Pa）随时间的变化曲线。
图。 2: LunaGel™样品测试后的代表性示例。
高刚度水凝胶在光照约0.5分钟后开始光交联，而低刚度水凝胶则在光照约1.5分钟后开始光交联（图3）。 高刚度配方的最终 G’ 值约为低刚度配方的 8 倍。低刚度配方形成了 G’ 值约为 550 Pa 的软凝胶，而高刚度水凝胶的 G’ 值达到了约 4 500 Pa，且猪源和牛源之间未发现统计学上的差异。 然而，两种明胶类型的高刚度与低刚度配方之间均存在显著差异。事实上，低刚度和高刚度 LunaGel™ 产品含有不同浓度的改性明胶成分，从而能够精确控制广泛的刚度范围。 最终的 tan(δ) 值始终低于 0.1，表明在这些水凝胶中，弹性行为（与剪切储能模量 G’’ 相关）远比粘性行为（与剪切损耗模量 G’’ 相关）更为显著。
图。 3: 光交联凝胶的初始交联时间（分钟）、最终G’值（帕）和最终tan(δ)值。
对于低刚度和高刚度两种配方，均可通过调整光照时间来达到低于或等于最终G’值的预期目标刚度。图4显示了高刚度猪源LunaGel™在9.0 mW/cm²光照强度下分别经2、4、8和10分钟光照后，剪切储能模量（G’，Pa）随时间的变化曲线。 同样，光照被设定为在上述持续时间的测试进行 2 分钟后开启。正如预期的那样，在前 4 分钟内，曲线几乎相同。在此时间点之后，对于光照时间较长的样品，G’ 随时间推移继续大幅增加。
图。 4: 高刚度猪源LunaGel™经405 nm光（9.0 mW/cm²）交联2、4、8和10分钟后，其剪切储能模量（G’，Pa）随时间的变化曲线。
为了研究LunaGel细胞外基质（ECM）刚度对乳腺癌细胞行为的影响，将MDA-MB-231细胞球分别接种在剪切储能模量（G’）分别为约110、220和440 kPa的细胞外基质上。 培养 7 天后，观察到不同 ECM 刚度条件下细胞形态存在显著差异（图 5）。 乳腺癌细胞的侵袭性随 ECM 刚度的增加而增强，这印证了临床数据所表明的：组织刚度较高的乳腺癌更容易发生转移。随着 LunaGel ECM 刚度的增加，观察到细胞形态向与转移相关的更具迁移性的形态转变（图 5，放大插图）。
图。 5: 乳腺癌细胞的侵袭性随细胞外基质（ECM）刚度的增加而增强。 图中显示了接种在LunaGel牛明胶细胞外基质（ECM）上的MDA-MB-231细胞球，其剪切储能模量分别为（A）110 Pa、（B）220 Pa和（C）440 Pa，培养7天后的状态。 对细胞/类球体进行了染色，分别显示细胞核（蓝色）、β1-整合素（绿色）、细胞膜（橙色）和肌动蛋白（洋红色）。
结论
利用 ElastoSens™ Bio 实时捕捉了LunaGel光交联产品中LunaGel™ ECM产品的粘弹性演变。与低刚度配方相比，高刚度的最终G’约高出8倍。这些水凝胶的最终粘弹性特性通过在交联过程中调整光照时间（405纳米）轻松调节。ECM刚度显著增强乳腺癌细胞的侵入性，展示了LunaGel™系统能紧密模拟生理和病理生理组织条件的能力。
摘要
- LunaGel™ 产品有助于开发具有所需刚度的水凝胶。
- ElastoSens™ Bio能够在水凝胶的粘弹性测量过程中照射不同波长的光，从而实时提供其光交联动力学数据。
- 在ElastoSens™ Bio中，水凝胶光交联过程中的光照强度和曝光时间可以轻松组合，以达到特定应用所需的目标粘弹性。
- LunaGel™ 细胞外基质（ECM）有助于研究细胞行为与细胞外基质刚度之间的关系。
参考文献
[1] Keely, P., & Nain, A. (2015). Capturing relevant extracellular matrices for investigating cell migration. F1000Research, 4.
[2] Wei, S. C., Fattet, L., Tsai, J. H., Guo, Y., Pai, V. H., Majeski, H. E., … & Yang, J. (2015). Matrix stiffness drives epithelial–mesenchymal transition and tumour metastasis through a TWIST1–G3BP2 mechanotransduction pathway. Nature cell biology, 17(5), 678-688.
[3] Paszek, M. J., Zahir, N., Johnson, K. R., Lakins, J. N., Rozenberg, G. I., Gefen, A., … & Weaver, V. M. (2005). Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell, 8(3), 241-254.
[4] Caliari, S. R., & Burdick, J. A. (2016). A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature methods, 13(5), 405-414.
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