Nota de Aplicação | ElastoSens™ Bio

Reticulação de hidrogel de alginato: caracterização da viscoelasticidade com o ElastoSens™ Bio

Em colaboração com

AVISO

Este estudo é fruto de uma colaboração conjunta entre a Rheolution (Montreal, QC, Canadá) e a CELLINK (Boston, MA, EUA).

Resumo

O alginato é um biomaterial natural obtido a partir de algas, amplamente utilizado para a administração de células e proteínas, bem como em aplicações de engenharia de tecidos.
O alginato sofre reticulação rápida na presença de cátions multivalentes (por exemplo, Ca²⁺) em soluções aquosas, resultando em um hidrogel com propriedades mecânicas ajustáveis.
A concentração mais baixa da solução de cloreto de cálcio provocou inchaço e resultou em uma reticulação mais lenta dos géis de alginato.
A maior concentração da solução de cloreto de cálcio proporcionou uma reticulação rápida, resultando no encolhimento dos géis de alginato.
A maior concentração da solução de cloreto de cálcio resultou em géis de alginato mais rígidos.
Os hidrogéis de alginato podem se dissolver quando incubados em uma solução salina sem cloreto de cálcio (por exemplo, PBS).

Aplicações do hidrogel de alginato e mecanismos de reticulação

Introdução

O alginato é um polissacarídeo presente como componente estrutural das algas e como componente capsular das bactérias do solo. Esse polissacarídeo é normalmente obtido a partir de algas marrons e utilizado em diversos setores, como o médico, o farmacêutico, o alimentício e o têxtil, devido às suas propriedades viscosificantes, gelificantes e estabilizantes. O alginato pode sofrer reticulação rapidamente na presença de cátions multivalentes (por exemplo, Ca²⁺) em soluções aquosas, resultando em um hidrogel com propriedades mecânicas ajustáveis. Esse processo simples e econômico, aliado à sua capacidade de reter grandes quantidades de líquido, torna o alginato um biomaterial valioso para aplicações biotecnológicas, como a administração de medicamentos e células e a engenharia de tecidos [1].

Os hidrogéis de alginato podem ser injetados no corpo ou implantados em um formato pré-moldado. No último caso, o alginato tem sido frequentemente processado por meio de impressão 3D baseada em extrusão, o que requer um processo de gelificação rápido. O polissacarídeo oferece gelificação rápida em condições suaves (quando misturado com cátions multivalentes) e, dessa forma, as células podem ser encapsuladas de maneira fácil e rápida [2].

As propriedades viscoelásticas do alginato podem ser ajustadas alterando-se diversos parâmetros, tais como a concentração e o peso molecular do polímero, bem como o tipo e a concentração do agente de reticulação. Nesta nota de aplicação, o alginato a 1% da CELLINK foi reticulado com solução de cloreto de cálcio (CaCl₂) em diferentes concentrações (10 mM e 50 mM), e suas propriedades viscoelásticas foram medidas no ElastoSens™ Bio após incubações sucessivas com a solução. Além disso, a estabilidade mecânica de uma formulação de alginato reticulado (10 mM) foi avaliada ao longo de 24 horas durante a incubação com uma solução salina (PBS).

Configuração experimental para avaliação da reticulação do hidrogel de alginato

Materiais e Métodos

Alginato 1% e CaCl2 (10 mM e 50 mM) foram adquiridos da CELLINK (Boston, EUA). Foram vertidos 3 mL de alginato no ElastoSens™ O porta-amostra da Bio e 3 mL do CaCl2 A solução foi adicionada cuidadosamente sobre a amostra e deixada agir por 15 minutos. Em seguida, a solução foi removida para a medição das propriedades viscoelásticas do alginato no ElastoSens™ Bio a 25 °C por 5 minutos (com um intervalo de 10 segundos). Esse último procedimento foi repetido durante as primeiras duas horas. Para as amostras reticuladas com CaCl2 A 10 mM, a solução foi deixada durante a noite à temperatura ambiente e uma última medição foi realizada aproximadamente 24 horas após a remoção da solução. Em seguida, adicionou-se PBS sem cálcio a essas amostras para avaliar sua dissolução ao longo do tempo a 37 °C. As medições foram realizadas a cada hora durante as primeiras 6 horas (durante 5 minutos, com intervalos de 10 segundos) e uma última medição foi realizada após 24 horas de incubação. Os resultados médios são expressos como média ± desvio-padrão. O número de amostras foi igual a 3 (n = 3). As análises estatísticas foram realizadas utilizando o GraphPad Prism versão 9 (software GraphPad Prism, La Jolla, CA, EUA). As comparações entre os grupos foram avaliadas por ANOVA unidirecional com teste post hoc de Tukey para correção de comparações múltiplas. Considerou-se que havia significância quando p < e a 0,05.

Efeitos da concentração de cloreto de cálcio nas propriedades do hidrogel de alginato

Resultados e Discussão

Três amostras de cada condição de reticulação (10 mM e 50 mM de CaCl₂) foram testadas periodicamente no ElastoSens™ Bio. Os valores médios em cada ponto temporal do módulo de armazenamento de cisalhamento G’ (Pa) e da altura da amostra (mm) do alginato com solução de 10 mM de CaCl₂ estão representados nas Figuras 1 e 2. Para as amostras reticuladas com CaCl₂ a 10 mM, os géis incharam nos momentos iniciais, o que é confirmado pelo aumento em sua altura média. A altura apresentou um aumento menos pronunciado após 45 minutos a 4 horas de incubação (Fig. 3A). A altura final após 24 horas mostrou que as amostras ainda apresentavam um inchaço significativo (68% maior do que a altura inicial). A ligeira diminuição do G’ nos primeiros 30 minutos sugere que o inchaço foi mais significativo do que as ligações cruzadas formadas até aquele momento. Depois disso, o G’ apresentou um aumento suave e esperado com o tempo, atingindo 645 ± 55 Pa após 4 horas de incubação com a solução de CaCl₂ (com diferenças estatísticas a cada 15 minutos). O valor final de G’ dos géis reticulados após 24 horas de incubação foi igual a 887 ± 9 Pa. O Tan(δ) mostrou-se estável de 15 minutos até 4 horas de incubação (~0,15); no entanto, apresentou um aumento após 24 horas, atingindo o valor de 0,3 (dados não mostrados). Esse aumento sugere que a fração viscosa do hidrogel tornou-se mais predominante com o tempo.

Figura 1. Módulo médio de armazenamento de cisalhamento (G’) e altura (mm) em função do tempo do alginato a 1% reticulado com uma solução de CaCl₂ a 10 mM (*p<0,0001 para 0 em comparação com cada hora).

Para as amostras reticuladas com CaCl₂ 50 mM, observou-se o comportamento contrário: as amostras encolheram com o tempo. Devido a esse comportamento, o teste foi interrompido assim que a amostra perdeu completamente o contato com a parede interna do suporte de amostras (Fig. 3B), o que é um requisito do teste. O valor de G’ aumentou com o tempo, atingindo o nível de 2.832 ± 53 Pa após 1,5 horas de incubação (com diferenças estatísticas a cada 5 minutos). A altura diminuiu com o tempo (devido ao encolhimento) e o valor de tan(δ) permaneceu estável (~ 0,15).

Figura 2. Módulo médio de armazenamento ao cisalhamento (G’) e altura (mm) em função do tempo do alginato a 1% reticulado com uma solução de CaCl₂ a 50 mM (*p<0,0001 para 0 versus cada hora).

Figura 3. Alginato a 1% reticulado com (A) 10 mM e (B) 50 mM de solução de CaCl₂.

A dissolução das amostras de alginato a 1%, reticuladas com solução de CaCl₂ a 10 mM e incubadas em PBS sem cálcio, foi avaliada ao longo de 24 horas. Os valores de G’ (Pa) em função do tempo são apresentados na Fig. 4. A dissolução do alginato por meio da liberação de íons cálcio no PBS foi significativa durante as primeiras 24 horas de incubação a 37 °C, conforme demonstrado pela diminuição de G’ com o tempo (redução de 20% após 24 horas). O monitoramento da dissolução foi possível durante as primeiras 24 horas; após esse período, a amostra deixou de ser um hidrogel coesivo.

Figura 4. Módulo médio de armazenamento de cisalhamento (G’) em função do tempo durante a incubação com PBS sem cálcio de alginato a 1% reticulado com uma solução de CaCl₂ a 10 mM (*p<0,0001 para 0 versus cada hora).

Conclusões e Perspectivas

A concentração da solução de CaCl₂ resultou em comportamentos diferentes durante a reticulação: o alginato inchou e encolheu com as concentrações mais baixa e mais alta, respectivamente (p<0,05). Isso esteve relacionado à velocidade de reticulação, que aumentou com o aumento da concentração de cálcio. Uma concentração mais elevada de cálcio resultou em hidrogéis mais rígidos (p<0,05). Observou-se a dissolução dos hidrogéis de alginato reticulados com solução de cálcio a 10 mM durante a incubação com PBS sem cálcio (p<0,05).

Os hidrogéis de alginato da Cellink podem ser facilmente reticulados com CaCl₂ e suas propriedades viscoelásticas ajustadas por meio da variação da concentração de cálcio.
As propriedades viscoelásticas da mesma amostra podem ser medidas no ElastoSens™ Bio após incubações sucessivas com o agente de reticulação.
Compreender o comportamento dos hidrogéis de alginato com diferentes soluções de reticulação é importante para planejar melhor os experimentos.
O ElastoSens™ Bio é capaz de detectar pequenas diferenças nas propriedades viscoelásticas dos hidrogéis de alginato durante a reticulação e a dissolução.

Referências

[1] Hecht, H., & Srebnik, S. (2016). Structural characterization of sodium alginate and calcium alginate. Biomacromolecules, 17(6), 2160-2167.

[2] Jia, J., Richards, D. J., Pollard, S., Tan, Y., Rodriguez, J., Visconti, R. P., … & Mei, Y. (2014). Engineering alginate as bioink for bioprinting. Acta biomaterialia, 10(10), 4323-4331.

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