Nota de aplicación | ElastoSens™ Bio

Reticulación del hidrogel de alginato: caracterización de la viscoelasticidad con ElastoSens™ Bio

En colaboración con

AVISO

Este estudio es fruto de una colaboración conjunta entre Rheolution (Montreal, QC, Canadá) y CELLINK (Boston, MA, EE. UU.).

Resumen

El alginato es un biomaterial natural que se obtiene de las algas y que se usa mucho para la administración de células y proteínas, así como en aplicaciones de ingeniería de tejidos.
El alginato se reticula rápidamente en presencia de cationes multivalentes (por ejemplo, Ca²⁺) en soluciones acuosas, lo que da lugar a un hidrogel con propiedades mecánicas ajustables.
La concentración más baja de la solución de cloruro de calcio provocó hinchazón y hizo que la reticulación de los geles de alginato fuera más lenta.
La mayor concentración de la solución de cloruro de calcio permitió una reticulación rápida, lo que provocó la contracción de los geles de alginato.
Una mayor concentración de la solución de cloruro de calcio dio lugar a geles de alginato más rígidos.
Los hidrogeles de alginato se pueden disolver una vez incubados en una solución salina sin cloruro de calcio (por ejemplo, PBS).

Aplicaciones del hidrogel de alginato y mecanismos de reticulación

Introducción

El alginato es un polisacárido que forma parte de la estructura de las algas y de la cápsula de las bacterias del suelo. Este polisacárido se suele obtener de las algas pardas y se usa en muchas industrias, como la médica, la farmacéutica, la alimentaria y la textil, gracias a sus propiedades viscosificantes, gelificantes y estabilizadoras. El alginato puede reticularse rápidamente en presencia de cationes multivalentes (por ejemplo, Ca²⁺) en soluciones acuosas, lo que da lugar a un hidrogel con propiedades mecánicas ajustables. Este proceso sencillo y económico, junto con su capacidad para retener grandes cantidades de líquido, convierte al alginato en un valioso biomaterial para aplicaciones biotecnológicas como la administración de fármacos y células y la ingeniería de tejidos [1].

Los hidrogeles de alginato se pueden inyectar en el cuerpo o implantar con una forma predefinida. En este último caso, el alginato se suele procesar mediante impresión 3D por extrusión, lo que requiere un proceso de gelificación rápido. Este polisacárido se gelifica rápidamente en condiciones suaves (cuando se mezcla con cationes multivalentes) y, de esta forma, las células se pueden encapsular fácil y rápidamente [2].

Las propiedades viscoelásticas del alginato se pueden ajustar modificando distintos parámetros, como la concentración y el peso molecular del polímero, así como el tipo y la concentración del agente reticulante. En esta nota de aplicación, se reticuló un 1 % de alginato de CELLINK con una solución de cloruro de calcio (CaCl₂) a diferentes concentraciones (10 mM y 50 mM) y se midieron sus propiedades viscoelásticas en el ElastoSens™ Bio tras varias incubaciones sucesivas con la solución. Además, se evaluó la estabilidad mecánica de una formulación de alginato reticulado (10 mM) durante 24 horas bajo incubación con una solución salina (PBS).

Configuración experimental para evaluar la reticulación del hidrogel de alginato

Materiales y métodos

Alginato al 1 % y CaCl2 (10 mM y 50 mM) se adquirieron en CELLINK (Boston, EE. UU.). Se vertieron 3 ml de alginato en el ElastoSens™ El portamuestras de Bio y 3 ml de la CaCl2 Se añadió con cuidado la solución sobre la muestra y se dejó actuar durante 15 minutos. A continuación, se retiró la solución para medir las propiedades viscoelásticas del alginato en el ElastoSens™ Bio a 25 °C durante 5 minutos (con un intervalo de 10 segundos). Este último procedimiento se repitió durante las dos primeras horas. Para las muestras reticuladas con CaCl2 A 10 mM, la solución se dejó toda la noche a temperatura ambiente y se realizó una última medición unas 24 horas después de retirar la solución. A continuación, se añadió PBS sin calcio a estas muestras para evaluar su disolución con el tiempo a 37 °C. Las mediciones se realizaron cada hora durante las primeras 6 horas (durante 5 minutos con un intervalo de 10 segundos) y se tomó una última medición tras 24 horas de incubación. Los resultados se expresan como media ± desviación estándar. El número de muestras fue de 3 (n = 3). Los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad Prism, versión 9 (software GraphPad Prism, La Jolla, CA, EE. UU.). Las comparaciones entre grupos se evaluaron mediante un ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Tukey para corregir las comparaciones múltiples. Se consideró que los resultados eran significativos cuando p < e a 0,05.

Efectos de la concentración de cloruro de calcio en las propiedades del hidrogel de alginato

Resultados y discusión

Se analizaron periódicamente tres muestras de cada condición de reticulación (10 mM y 50 mM de CaCl₂) en el ElastoSens™ Bio. En las figuras 1 y 2 se muestran los valores medios en cada momento del módulo de almacenamiento de cizallamiento G’ (Pa) y la altura de la muestra (mm) del alginato con una solución de 10 mM de CaCl₂. En el caso de las muestras reticuladas con 10 mM de CaCl₂, los geles se hincharon en los primeros momentos, lo que se confirma por el aumento de su altura media. La altura mostró un aumento menos pronunciado tras 45 minutos y hasta 4 horas de incubación (fig. 3A). La altura final tras 24 horas mostró que las muestras seguían presentando un hinchamiento significativo (un 68 % mayor que la altura inicial). La ligera disminución del G’ en los primeros 30 minutos sugiere que el hinchamiento fue más significativo que los enlaces cruzados formados hasta ese momento. A partir de ahí, el valor de G’ mostró un aumento suave y previsible con el tiempo, alcanzando los 645 ± 55 Pa tras 4 horas de incubación con la solución de CaCl₂ (con diferencias estadísticas cada 15 minutos). El valor final de G’ de los geles reticulados tras 24 horas de incubación fue de 887 ± 9 Pa. Tan(δ) se mantuvo estable desde los 15 minutos hasta las 4 horas de incubación (~0,15); sin embargo, aumentó tras 24 horas, alcanzando el valor de 0,3 (datos no mostrados). Este aumento sugiere que la parte viscosa del hidrogel se hizo más predominante con el tiempo.

Figura 1. Módulo de almacenamiento de cizallamiento medio (G’) y altura (mm) en función del tiempo del alginato al 1 % reticulado con una solución de CaCl₂ a 10 mM (*p<0,0001 para 0 frente a cada hora).

En las muestras reticuladas con 50 mM de CaCl₂, se observó justo lo contrario: las muestras se encogieron con el tiempo. Por este motivo, la prueba se detuvo en cuanto la muestra dejó de estar en contacto total con la pared interior del soporte (fig. 3B), que es un requisito de la prueba. El valor de G’ aumentó con el tiempo hasta alcanzar los 2832 ± 53 Pa tras 1,5 horas de incubación (con diferencias estadísticas cada 5 minutos). La altura disminuyó con el tiempo (debido a la contracción) y el valor de tan(δ) se mantuvo estable (~ 0,15).

Figura 2. Módulo de almacenamiento a cizallamiento medio (G’) y altura (mm) en función del tiempo del alginato al 1 % reticulado con una solución de CaCl₂ a 50 mM (*p<0,0001 para 0 frente a cada hora).

Figura 3. Alginato al 1 % reticulado con (A) 10 mM y (B) 50 mM de solución de CaCl₂.

Se evaluó la disolución de las muestras de alginato al 1 %, reticuladas con una solución de CaCl₂ a 10 mM e incubadas en PBS sin calcio, a lo largo de 24 horas. En la figura 4 se muestran los valores de G’ (Pa) en función del tiempo. La disolución del alginato por la liberación de iones de calcio en el PBS fue significativa durante las primeras 24 horas de incubación a 37 °C, como muestra la disminución de G’ con el tiempo (una disminución del 20 % tras 24 horas). Se pudo seguir la disolución durante las primeras 24 horas; después de ese tiempo, la muestra ya no era un hidrogel cohesivo.

Figura 4. Módulo de almacenamiento de cizallamiento medio (G’) en función del tiempo durante la incubación con PBS sin calcio de alginato al 1 % reticulado con una solución de CaCl₂ a 10 mM (*p<0,0001 para 0 frente a cada hora).

Conclusiones y perspectivas

La concentración de la solución de CaCl₂ provocó comportamientos diferentes durante la reticulación: el alginato se hinchó con la concentración más baja y se encogió con la más alta (p<0,05). Esto se debió a la velocidad de reticulación, que aumentaba al aumentar la concentración de calcio. Una mayor concentración de calcio dio lugar a hidrogeles más rígidos (p<0,05). Se observó la disolución de los hidrogeles de alginato reticulados con una solución de calcio de 10 mM durante la incubación con PBS sin calcio (p<0,05).

Los hidrogeles de alginato de Cellink se pueden reticular fácilmente con CaCl₂ y sus propiedades viscoelásticas se pueden ajustar variando la concentración de calcio.
Las propiedades viscoelásticas de la misma muestra se pueden medir en el ElastoSens™ Bio tras varias incubaciones sucesivas con el agente reticulante.
Entender cómo se comportan los hidrogeles de alginato con diferentes soluciones de reticulación es muy útil para diseñar mejor los experimentos.
ElastoSens™ Bio es capaz de detectar ligeras diferencias en las propiedades viscoelásticas de los hidrogeles de alginato durante la reticulación y la disolución.

Referencias

[1] Hecht, H., & Srebnik, S. (2016). Structural characterization of sodium alginate and calcium alginate. Biomacromolecules, 17(6), 2160-2167.

[2] Jia, J., Richards, D. J., Pollard, S., Tan, Y., Rodriguez, J., Visconti, R. P., … & Mei, Y. (2014). Engineering alginate as bioink for bioprinting. Acta biomaterialia, 10(10), 4323-4331.

Descubre cómo nuestra tecnología mide de forma no destructiva las propiedades viscoelásticas de los biomateriales blandos y los tejidos utilizando microvolúmenes de muestras