Nota applicativa | ElastoSens™ Bio

Reticolazione dell'idrogel di alginato: caratterizzazione della viscoelasticità con ElastoSens™ Bio

In collaborazione con

AVVISO

Questo studio è frutto di una collaborazione tra Rheolution (Montreal, QC, Canada) e CELLINK (Boston, MA, USA).

Sintesi

L’alginato è un biomateriale naturale ricavato dalle alghe, ampiamente utilizzato per il rilascio di cellule e proteine e per applicazioni nell’ingegneria tissutale.
L’alginato si reticola rapidamente in presenza di cationi multivalenti (ad es. Ca²⁺) in soluzioni acquose, dando origine a un idrogel con proprietà meccaniche regolabili.
La concentrazione più bassa della soluzione di cloruro di calcio ha provocato un rigonfiamento e ha portato a una reticolazione più lenta dei gel di alginato.
La maggiore concentrazione della soluzione di cloruro di calcio ha favorito una reticolazione rapida, causando il restringimento dei gel di alginato.
Una maggiore concentrazione della soluzione di cloruro di calcio ha portato alla formazione di gel di alginato più rigidi.
Gli idrogel di alginato possono dissolversi se incubati in una soluzione salina priva di cloruro di calcio (ad esempio, PBS).

Applicazioni dell'idrogel di alginato e meccanismi di reticolazione

Introduzione

L’alginato è un polisaccaride presente come componente strutturale delle alghe e come componente capsulare dei batteri del suolo. Questo polisaccaride viene solitamente ricavato dalle alghe brune e viene utilizzato in molti settori, come quello medico, farmaceutico, alimentare e tessile, grazie alle sue proprietà viscosizzanti, gelificanti e stabilizzanti. L’alginato può reticolarsi rapidamente in presenza di cationi multivalenti (ad es. Ca²⁺) in soluzioni acquose, dando origine a un idrogel con proprietà meccaniche regolabili. Questo processo semplice ed economico, unito alla sua capacità di trattenere grandi quantità di liquido, rende l’alginato un biomateriale prezioso per applicazioni biotecnologiche come il rilascio di farmaci e cellule e l’ingegneria tissutale [1].

Gli idrogel di alginato possono essere iniettati nel corpo o impiantati in una forma predefinita. In quest’ultimo caso, l’alginato viene spesso lavorato tramite stampa 3D a estrusione, che richiede un processo di gelificazione veloce. Questo polisaccaride gelifica rapidamente in condizioni moderate (quando viene miscelato con cationi multivalenti) e, in questo modo, le cellule possono essere incapsulate facilmente e velocemente [2].

Le proprietà viscoelastiche dell’alginato possono essere regolate modificando diversi parametri, come la concentrazione e il peso molecolare del polimero, nonché il tipo e la concentrazione dell’agente reticolante. In questa nota applicativa, l’alginato all’1% di CELLINK è stato reticolato con una soluzione di cloruro di calcio (CaCl₂) a diverse concentrazioni (10 mM e 50 mM) e le sue proprietà viscoelastiche sono state misurate con ElastoSens™ Bio dopo incubazioni successive con la soluzione. Inoltre, è stata valutata la stabilità meccanica di una formulazione di alginato reticolato (10 mM) nell’arco di 24 ore durante l’incubazione con una soluzione salina (PBS).

Configurazione sperimentale per la valutazione della reticolazione dell'idrogel di alginato

Materiali e metodi

Alginato 1% e CaCl2 (10 mM e 50 mM) sono stati acquistati da CELLINK (Boston, USA). Sono stati versati 3 mL di alginato nell’ElastoSens™ Il portacampioni Bio e 3 mL del CaCl2 La soluzione è stata versata delicatamente sulla superficie del campione e lasciata agire per 15 minuti. La soluzione è stata poi rimossa per misurare le proprietà viscoelastiche dell’alginato con ElastoSens™ Bio a 25 °C per 5 minuti (con un intervallo temporale di 10 secondi). Quest’ultima procedura è stata ripetuta per le prime due ore. Per i campioni reticolati con CaCl2 A 10 mM, la soluzione è stata lasciata riposare per tutta la notte a temperatura ambiente e un’ultima misurazione è stata effettuata circa 24 ore dopo aver rimosso la soluzione. A questi campioni è stato poi aggiunto PBS privo di calcio per valutare la loro dissoluzione nel tempo a 37 °C. Le misurazioni sono state effettuate ogni ora per le prime 6 ore (per 5 minuti con un intervallo temporale di 10 secondi) e un’ultima misurazione è stata effettuata dopo 24 ore di incubazione. I risultati medi sono espressi come media ± deviazione standard. Il numero di campioni era pari a 3 (n = 3). Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando GraphPad Prism versione 9 (GraphPad Prism software, La Jolla, CA, USA). I confronti tra i gruppi sono stati valutati mediante ANOVA a una via con test post-hoc di Tukey per correggere i confronti multipli. Si è considerato significativo un valore di p < e a 0,05.

Effetti della concentrazione di cloruro di calcio sulle proprietà dell'idrogel di alginato

Risultati e discussione

Sono stati analizzati periodicamente nell’ElastoSens™ Bio tre campioni per ciascuna condizione di reticolazione (10 mM e 50 mM di CaCl₂). I valori medi in ciascun intervallo di tempo del modulo di immagazzinamento al taglio G’ (Pa) e dell’altezza del campione (mm) dell’alginato con soluzione di CaCl₂ a 10 mM sono riportati nelle figure 1 e 2. Per i campioni reticolati con 10 mM di CaCl₂, i gel si sono gonfiati nei primi momenti, come conferma l’aumento della loro altezza media. L’altezza ha mostrato un aumento meno marcato dopo 45 minuti e fino a 4 ore di incubazione (Fig. 3A). L’altezza finale dopo 24 ore ha mostrato che i campioni presentavano ancora un rigonfiamento significativo (superiore del 68% rispetto all’altezza iniziale). La leggera diminuzione del G’ nei primi 30 minuti suggerisce che il rigonfiamento fosse più significativo dei legami di reticolazione formatisi fino a quel momento. Successivamente, il valore di G’ ha mostrato un aumento graduale e previsto nel tempo, raggiungendo 645 ± 55 Pa dopo 4 ore di incubazione con la soluzione di CaCl₂ (con differenze statistiche ogni 15 minuti). Il valore finale di G’ dei gel reticolati dopo 24 ore di incubazione era pari a 887 ± 9 Pa. Il Tan(δ) si è dimostrato stabile da 15 minuti fino a 4 ore di incubazione (~ 0,15), ma ha mostrato un aumento dopo 24 ore, raggiungendo il valore di 0,3 (dati non mostrati). Questo aumento suggerisce che la componente viscosa dell’idrogel sia diventata più predominante con il passare del tempo.

Figura 1. Modulo di immagazzinamento di taglio medio (G’) e altezza (mm) in funzione del tempo dell’alginato all’1% reticolato con una soluzione di CaCl₂ a 10 mM (*p<0,0001 per 0 rispetto a ogni ora).

Per i campioni reticolati con 50 mM di CaCl₂, si è osservato il comportamento opposto: i campioni si sono rimpiccioliti col passare del tempo. A causa di questo comportamento, il test è stato interrotto non appena il campione ha perso completamente il contatto con la parete interna del portacampioni (Fig. 3B), come previsto dal protocollo. Il valore di G’ è aumentato col passare del tempo, raggiungendo il livello di 2832 ± 53 Pa dopo 1,5 ore di incubazione (con differenze statistiche ogni 5 minuti). L’altezza è diminuita col passare del tempo (a causa del restringimento) e il valore di tan(δ) è rimasto stabile (~ 0,15).

Figura 2. Modulo di immagazzinamento di taglio medio (G’) e altezza (mm) in funzione del tempo dell’alginato all’1% reticolato con una soluzione di CaCl₂ a 50 mM (*p<0,0001 per 0 rispetto a ogni ora).

Figura 3. Alginato all’1% reticolato con una soluzione di CaCl₂ a (A) 10 mM e (B) 50 mM.

È stata valutata la dissoluzione dei campioni di alginato all’1% reticolati con una soluzione di CaCl₂ a 10 mM e incubati in PBS privo di calcio nell’arco di 24 ore. I valori di G’ (Pa) in funzione del tempo sono riportati nella Fig. 4. La dissoluzione dell’alginato dovuta al rilascio di ioni calcio nel PBS è stata significativa durante le prime 24 ore di incubazione a 37 °C, come dimostra la diminuzione di G’ nel tempo (calo del 20% dopo 24 ore). È stato possibile monitorare la dissoluzione solo durante le prime 24 ore; successivamente, il campione non era più un idrogel coeso.

Figura 4. Modulo di stoccaggio di taglio medio (G’) in funzione del tempo durante l’incubazione con PBS senza calcio dell’alginato all’1% reticolato con una soluzione di CaCl₂ a 10 mM (*p<0,0001 per 0 rispetto a ciascuna ora).

Conclusioni e prospettive

La concentrazione della soluzione di CaCl₂ ha determinato comportamenti diversi durante la reticolazione: l’alginato si è gonfiato alla concentrazione più bassa e si è ritirato a quella più alta (p<0,05). Questo era legato alla velocità di reticolazione, che aumentava all’aumentare della concentrazione di calcio. Una maggiore concentrazione di calcio ha portato a idrogel più rigidi (p<0,05). È stata osservata la dissoluzione degli idrogel di alginato reticolati con una soluzione di calcio a 10 mM durante l’incubazione con PBS privo di calcio (p<0,05).

Gli idrogel di alginato di Cellink possono essere facilmente reticolati con CaCl₂ e le loro proprietà viscoelastiche possono essere regolate variando la concentrazione di calcio.
Le proprietà viscoelastiche dello stesso campione possono essere misurate con ElastoSens™ Bio dopo incubazioni successive con l’agente reticolante.
Capire come si comportano gli idrogel di alginato con diverse soluzioni reticolanti è utile per progettare meglio gli esperimenti.
ElastoSens™ Bio è in grado di rilevare lievi differenze nelle proprietà viscoelastiche degli idrogel di alginato durante la reticolazione e la dissoluzione.

Riferimenti

[1] Hecht, H., & Srebnik, S. (2016). Structural characterization of sodium alginate and calcium alginate. Biomacromolecules, 17(6), 2160-2167.

[2] Jia, J., Richards, D. J., Pollard, S., Tan, Y., Rodriguez, J., Visconti, R. P., … & Mei, Y. (2014). Engineering alginate as bioink for bioprinting. Acta biomaterialia, 10(10), 4323-4331.

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