Note d’application | ElastoSens™ Bio

Réticulation de l'hydrogel d'alginate : caractérisation de la viscoélasticité à l'aide d'ElastoSens™ Bio

En collaboration avec

AVIS

Cette étude est le fruit d’une collaboration entre Rheolution (Montréal, QC, Canada) et CELLINK (Boston, MA, États-Unis).

Résumé

L’alginate est un biomatériau naturel issu d’algues, largement utilisé pour l’administration de cellules et de protéines, ainsi que dans le domaine de l’ingénierie tissulaire.
L’alginate se réticule rapidement en présence de cations multivalents (par exemple, Ca²⁺) dans des solutions aqueuses, ce qui donne naissance à un hydrogel dont les propriétés mécaniques peuvent être ajustées.
La concentration la plus faible de la solution de chlorure de calcium a provoqué un gonflement et entraîné une réticulation plus lente des gels d’alginate.
La concentration plus élevée de la solution de chlorure de calcium a permis une réticulation rapide, entraînant le rétrécissement des gels d’alginate.
Une concentration plus élevée de la solution de chlorure de calcium a permis d’obtenir des gels d’alginate plus rigides.
Les hydrogels d’alginate peuvent se dissoudre lorsqu’ils sont incubés dans une solution saline ne contenant pas de chlorure de calcium (par exemple, du PBS).

Applications de l'hydrogel d'alginate et mécanismes de réticulation

Introduction

L’alginate est un polysaccharide présent en tant que composant structurel des algues et en tant que composant capsulaire des bactéries du sol. Ce polysaccharide est généralement extrait d’algues brunes et utilisé dans de nombreux secteurs, tels que les secteurs médical, pharmaceutique, alimentaire et textile, en raison de ses propriétés viscosifiantes, gélifiantes et stabilisantes. L’alginate peut se réticuler rapidement en présence de cations multivalents (par exemple, Ca²⁺) dans des solutions aqueuses, ce qui donne naissance à un hydrogel dont les propriétés mécaniques sont modulables. Ce procédé simple et économique, associé à sa capacité à retenir de grandes quantités de liquide, fait de l’alginate un biomatériau précieux pour des applications biotechnologiques telles que l’administration de médicaments et de cellules, ainsi que l’ingénierie tissulaire [1].

Les hydrogels d’alginate peuvent être injectés dans l’organisme ou implantés sous une forme préformée. Dans ce dernier cas, l’alginate est souvent traité par impression 3D par extrusion, ce qui nécessite un processus de gélification rapide. Ce polysaccharide présente une gélification rapide dans des conditions modérées (lorsqu’il est mélangé à des cations multivalents) et permet ainsi d’encapsuler facilement et rapidement les cellules [2].

Les propriétés viscoélastiques de l’alginate peuvent être ajustées en modifiant différents paramètres, tels que la concentration en polymère et le poids moléculaire, ainsi que le type et la concentration de l’agent de réticulation. Dans cette note d’application, de l’alginate à 1 % de CELLINK a été réticulé avec une solution de chlorure de calcium (CaCl₂) à différentes concentrations (10 mM et 50 mM), puis ses propriétés viscoélastiques ont été mesurées à l’aide de l’ElastoSens™ Bio après des incubations successives avec cette solution. De plus, la stabilité mécanique d’une formulation d’alginate réticulé (10 mM) a été évaluée sur une période de 24 heures lors d’une incubation avec une solution saline (PBS).

Montage expérimental destiné à évaluer la réticulation d'un hydrogel d'alginate

Matériel et méthodes

Alginate 1 % et CaCl2 (10 mM et 50 mM) ont été fournis par CELLINK (Boston, États-Unis). On a versé 3 ml d’alginate dans l’ElastoSens™ Le porte-échantillon Bio et 3 ml de la CaCl2 La solution a été versée délicatement sur l’échantillon et laissée en place pendant 15 minutes. Elle a ensuite été retirée afin de mesurer les propriétés viscoélastiques de l’alginate à l’aide de l’ElastoSens™ Bio à 25 °C pendant 5 minutes (avec un intervalle de 10 secondes). Cette dernière procédure a été répétée pendant les deux premières heures. Pour les échantillons réticulés avec CaCl2 À une concentration de 10 mM, la solution a été laissée toute la nuit à température ambiante et une dernière mesure a été effectuée environ 24 heures après le retrait de la solution. Du PBS sans calcium a ensuite été ajouté à ces échantillons afin d’évaluer leur dissolution en fonction du temps à 37 °C. Les mesures ont été effectuées toutes les heures pendant les 6 premières heures (pendant 5 minutes avec un intervalle de 10 secondes), puis une dernière mesure a été effectuée après 24 heures d’incubation. Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± écart-type. Le nombre d’échantillons était de 3 (n = 3). Les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide du logiciel GraphPad Prism version 9 (GraphPad Prism, La Jolla, Californie, États-Unis). Les comparaisons entre les groupes ont été évaluées par une ANOVA à un facteur, suivie d’un test post-hoc de Tukey afin de corriger les comparaisons multiples. La significativité a été retenue lorsque la valeur de p < ait 0,05.

Effets de la concentration en chlorure de calcium sur les propriétés de l'hydrogel d'alginate

Résultats et discussion

Trois échantillons pour chaque condition de réticulation (10 mM et 50 mM de CaCl₂) ont été testés périodiquement à l’aide de l’ElastoSens™ Bio. Les valeurs moyennes, à chaque intervalle de temps, du module de stockage en cisaillement G’ (Pa) et de la hauteur de l’échantillon (mm) de l’alginate avec une solution de CaCl₂ à 10 mM sont représentées sur les figures 1 et 2. Pour les échantillons réticulés avec 10 mM de CaCl₂, les gels ont gonflé aux premiers instants, ce qui est confirmé par l’augmentation de leur hauteur moyenne. Cette hauteur a présenté une augmentation moins prononcée après 45 minutes à 4 heures d’incubation (fig. 3A). La hauteur finale après 24 heures a montré que les échantillons présentaient encore un gonflement significatif (supérieur de 68 % à la hauteur initiale). La légère diminution du G’ au cours des 30 premières minutes suggère que le gonflement était plus important que les liaisons transversales formées jusqu’à ce moment-là. Par la suite, la valeur G’ a affiché une augmentation progressive et conforme aux prévisions au fil du temps, atteignant 645 ± 55 Pa après 4 heures d’incubation avec la solution de CaCl₂ (avec des différences statistiques toutes les 15 minutes). La valeur finale de G’ des gels réticulés après 24 heures d’incubation était égale à 887 ± 9 Pa. La valeur de Tan(δ) s’est révélée stable entre 15 minutes et 4 heures d’incubation (~ 0,15) ; toutefois, elle a augmenté après 24 heures pour atteindre la valeur de 0,3 (données non présentées). Cette augmentation suggère que la fraction visqueuse de l’hydrogel est devenue plus prédominante avec le temps.

Figure 1. Module de stockage en cisaillement moyen (G’) et hauteur (mm) en fonction du temps pour l’alginate à 1 % réticulé avec une solution de CaCl₂ à 10 mM (*p<0,0001 pour la valeur à 0 heure par rapport à chaque heure suivante).

Pour les échantillons réticulés avec du CaCl₂ à 50 mM, on a observé un comportement inverse : les échantillons se sont rétrécis avec le temps. En raison de ce comportement, l’essai a été interrompu dès que l’échantillon a perdu tout contact avec la paroi interne du support d’échantillon (fig. 3B), ce qui constitue une condition requise pour l’essai. La valeur de G’ a augmenté avec le temps pour atteindre 2 832 ± 53 Pa après 1,5 heure d’incubation (avec des différences statistiques toutes les 5 minutes). La hauteur a diminué avec le temps (en raison du rétrécissement) et la valeur de tan(δ) est restée stable (~ 0,15).

Figure 2. Module de stockage en cisaillement moyen (G’) et hauteur (mm) en fonction du temps pour l’alginate à 1 % réticulé avec une solution de CaCl₂ à 50 mM (*p<0,0001 pour la valeur à 0 heure par rapport à chaque heure suivante).

Figure 3. Alginate à 1 % réticulé avec (A) une solution de CaCl₂ à 10 mM et (B) une solution de CaCl₂ à 50 mM.

La dissolution des échantillons d’alginate à 1 % réticulés avec une solution de CaCl₂ à 10 mM et incubés dans du PBS sans calcium a été évaluée sur une période de 24 heures. Les valeurs de G’ (Pa) en fonction du temps sont présentées à la figure 4. La dissolution de l’alginate due à la libération d’ions calcium dans le PBS s’est avérée significative au cours des 24 premières heures d’incubation à 37 °C, comme le montre la diminution de G’ en fonction du temps (baisse de 20 % après 24 heures). Le suivi de la dissolution a été possible pendant les premières 24 heures ; au-delà, l’échantillon n’était plus un hydrogel cohésif.

Figure 4. Module de stockage en cisaillement moyen (G’) en fonction du temps au cours de l’incubation avec du PBS sans calcium d’un alginate à 1 % réticulé avec une solution de CaCl₂ à 10 mM (*p<0,0001 pour la valeur à 0 heure par rapport à chaque heure suivante).

Conclusions et perspectives

La concentration de la solution de CaCl₂ a entraîné des comportements différents au cours de la réticulation : l’alginate a gonflé à la concentration la plus faible et s’est rétréci à la concentration la plus élevée (p<0,05). Ce phénomène était lié à la vitesse de réticulation, qui augmentait à mesure que la concentration en calcium augmentait. Une concentration en calcium plus élevée a donné lieu à des hydrogels plus rigides (p<0,05). Une dissolution des hydrogels d’alginate réticulés avec une solution de calcium à 10 mM a été observée lors de l’incubation avec du PBS sans calcium (p<0,05).

Les hydrogels d’alginate de Cellink peuvent être facilement réticulés à l’aide de CaCl₂ et leurs propriétés viscoélastiques peuvent être ajustées en modifiant la concentration en calcium.
Les propriétés viscoélastiques d’un même échantillon peuvent être mesurées dans l’ElastoSens™ Bio après des incubations successives avec l’agent de réticulation.
Il est utile de comprendre le comportement des hydrogels d’alginate obtenus avec différentes solutions de réticulation afin de mieux concevoir vos expériences.
ElastoSens™ Bio est capable de détecter de légères variations des propriétés viscoélastiques des hydrogels d’alginate au cours de leur réticulation et de leur dissolution.

Références

[1] Hecht, H., & Srebnik, S. (2016). Structural characterization of sodium alginate and calcium alginate. Biomacromolecules, 17(6), 2160-2167.

[2] Jia, J., Richards, D. J., Pollard, S., Tan, Y., Rodriguez, J., Visconti, R. P., … & Mei, Y. (2014). Engineering alginate as bioink for bioprinting. Acta biomaterialia, 10(10), 4323-4331.

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