Anwendungshinweis | ElastoSens™ Bio

Vernetzung von Alginat-Hydrogel: Charakterisierung der Viskoelastizität mit ElastoSens™ Bio

In Zusammenarbeit mit

HINWEIS

Diese Studie ist das Ergebnis einer Zusammenarbeit zwischen Rheolution (Montreal, QC, Kanada) und CELLINK (Boston, MA, USA).

Zusammenfassung

Alginat ist ein natürliches Biomaterial, das aus Algen gewonnen wird und in großem Umfang für die Zell- und Proteinverabreichung sowie für Anwendungen im Bereich des Tissue Engineering eingesetzt wird.
Alginat vernetzt sich in wässrigen Lösungen in Gegenwart mehrwertiger Kationen (z. B. Ca²⁺) rasch, wodurch ein Hydrogel mit einstellbaren mechanischen Eigenschaften entsteht.
Die niedrigste Konzentration der Kalziumchloridlösung führte zu einer Quellung und bewirkte eine langsamere Vernetzung der Alginatgele.
Die höhere Konzentration der Kalziumchloridlösung führte zu einer schnellen Vernetzung, was wiederum ein Schrumpfen der Alginatgele zur Folge hatte.
Die höhere Konzentration der Kalziumchloridlösung führte zu festeren Alginatgelen.
Alginat-Hydrogele können sich auflösen, sobald sie in einer Kochsalzlösung ohne Kalziumchlorid (z. B. PBS) inkubiert werden.

Anwendungsbereiche von Alginat-Hydrogelen und Vernetzungsmechanismen

Einleitung

Alginat ist ein Polysaccharid, das als Strukturbestandteil von Algen und als Kapselbestandteil von Bodenbakterien vorkommt. Das Polysaccharid wird in der Regel aus Braunalgen gewonnen und aufgrund seiner viskositätserhöhenden, gelbildenden und stabilisierenden Eigenschaften in vielen Branchen wie der Medizin-, Pharma-, Lebensmittel- und Textilindustrie eingesetzt. Alginat kann in wässrigen Lösungen in Gegenwart mehrwertiger Kationen (z. B. Ca²⁺) schnell vernetzen, wodurch ein Hydrogel mit einstellbaren mechanischen Eigenschaften entsteht. Dieses einfache und kostengünstige Verfahren sowie seine Fähigkeit, große Mengen an Flüssigkeit zu binden, machen Alginat zu einem wertvollen Biomaterial für biotechnologische Anwendungen wie die Wirkstoff- und Zellverabreichung sowie das Tissue Engineering [1].

Alginat-Hydrogele können in den Körper injiziert oder in vorgeformter Gestalt implantiert werden. Im letzteren Fall wurde Alginat häufig mittels extrusionsbasiertem 3D-Druck verarbeitet, was einen schnellen Gelierungsprozess erfordert. Das Polysaccharid geliert unter milden Bedingungen (bei Vermischung mit mehrwertigen Kationen) schnell, wodurch Zellen einfach und zügig eingekapselt werden können [2].

Die viskoelastischen Eigenschaften von Alginat lassen sich durch Variation verschiedener Parameter wie Polymerkonzentration und Molekulargewicht sowie Art und Konzentration des Vernetzungsmittels einstellen. In diesem Anwendungshinweis wurde 1 %iges Alginat von CELLINK mit einer Kalziumchlorid (CaCl₂)-Lösung in unterschiedlichen Konzentrationen (10 mM und 50 mM) vernetzt, und seine viskoelastischen Eigenschaften wurden nach aufeinanderfolgenden Inkubationen mit der Lösung im ElastoSens™ Bio gemessen. Darüber hinaus wurde die mechanische Stabilität einer vernetzten Alginatformulierung (10 mM) über einen Zeitraum von 24 Stunden bei Inkubation mit einer Kochsalzlösung (PBS) bewertet.

Versuchsaufbau zur Untersuchung der Vernetzung von Alginat-Hydrogelen

Materialien und Methoden

Alginat 1 % und CaCl2 (10 mM und 50 mM) wurden von CELLINK (Boston, USA) bezogen. 3 ml Alginat wurden in den ElastoSens™ gegossen Der Probenhalter von Bio und 3 ml der CaCl2 Die Lösung wurde vorsichtig auf die Probe aufgetragen und 15 Minuten lang einwirken gelassen. Anschließend wurde die Lösung entfernt, um die viskoelastischen Eigenschaften des Alginats im ElastoSens™ zu messen. 5 Minuten lang bei 25 °C (mit einem zeitlichen Schritt von 10 Sekunden). Dieser letzte Vorgang wurde in den ersten paar Stunden wiederholt. Bei den Proben, die mit CaCl2 Bei einer Konzentration von 10 mM wurde die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen, und eine abschließende Messung erfolgte etwa 24 Stunden nach Entnahme der Lösung. Anschließend wurde diesen Proben kalziumfreies PBS zugesetzt, um deren Auflösung im Zeitverlauf bei 37 °C zu bewerten. Die Messungen erfolgten in den ersten 6 Stunden stündlich (jeweils 5 Minuten lang mit einem zeitlichen Schritt von 10 Sekunden), und eine letzte Messung wurde nach 24 Stunden Inkubation durchgeführt. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben. Die Anzahl der Proben betrug 3 (n = 3). Die statistischen Auswertungen wurden mit GraphPad Prism Version 9 (GraphPad Prism Software, La Jolla, CA, USA) durchgeführt. Vergleiche zwischen den Gruppen wurden mittels einfaktorieller Varianzanalyse (ANOVA) mit anschließendem Tukey-Post-hoc-Test zur Korrektur für Mehrfachvergleiche ausgewertet. Als signifikant wurde ein p- < r 0,05 angesehen.

Einfluss der Kalziumchloridkonzentration auf die Eigenschaften von Alginat-Hydrogelen

Ergebnisse und Diskussion

Drei Proben jeder Vernetzungsbedingung (10 mM und 50 mM CaCl₂) wurden in regelmäßigen Abständen im ElastoSens™ Bio untersucht. Die Durchschnittswerte des Scherspeichermoduls G’ (Pa) und der Probenhöhe (mm) von Alginat mit einer 10 mM CaCl₂-Lösung zu den jeweiligen Zeitpunkten sind in Abb. 1 und 2 dargestellt. Bei den mit 10 mM CaCl₂ vernetzten Proben quollen die Gele zu Beginn an, was durch den Anstieg ihrer durchschnittlichen Höhe bestätigt wird. Nach einer Inkubationszeit von 45 Minuten bis 4 Stunden zeigte die Höhe einen weniger ausgeprägten Anstieg (Abb. 3A). Die Endhöhe nach 24 Stunden zeigte, dass die Proben immer noch eine signifikante Quellung aufwiesen (68 % höher als die Anfangshöhe). Der leichte Rückgang des G’ in den ersten 30 Minuten deutet darauf hin, dass die Quellung bis zu diesem Zeitpunkt stärker war als die gebildeten Vernetzungen. Danach zeigte der G‘-Wert einen sanften und erwarteten Anstieg mit der Zeit und erreichte nach 4 Stunden Inkubation mit der CaCl₂-Lösung einen Wert von 645 ± 55 Pa (mit statistisch signifikanten Unterschieden alle 15 Minuten). Der Endwert von G’ der vernetzten Gele nach 24-stündiger Inkubation betrug 887 ± 9 Pa. Tan(δ) blieb von 15 Minuten bis zu 4 Stunden Inkubation stabil (~ 0,15), stieg jedoch nach 24 Stunden an und erreichte den Wert von 0,3 (Daten nicht gezeigt). Dieser Anstieg deutet darauf hin, dass der viskose Anteil des Hydrogels mit der Zeit an Bedeutung gewann.

Abbildung 1. Durchschnittlicher Scherspeichermodul (G’) und Höhe (mm) in Abhängigkeit von der Zeit bei 1 % Alginat, vernetzt mit einer 10 mM CaCl₂-Lösung (*p-<t 0,0001 für 0 gegenüber jeder Stunde).

Bei den mit 50 mM CaCl₂ vernetzten Proben wurde das gegenteilige Verhalten beobachtet: Die Proben schrumpften mit der Zeit. Aufgrund dieses Verhaltens wurde der Test beendet, sobald die Probe den vollständigen Kontakt zur Innenwand des Probenhalters verloren hatte (Abb. 3B), was eine Voraussetzung für den Test darstellt. Der G‘-Wert stieg mit der Zeit an und erreichte nach 1,5 Stunden Inkubation einen Wert von 2832 ± 53 Pa (mit statistisch signifikanten Unterschieden alle 5 Minuten). Die Höhe nahm mit der Zeit ab (aufgrund des Schrumpfens), und der tan(δ)-Wert blieb stabil (~ 0,15).

Abbildung 2. Durchschnittlicher Scherspeichermodul (G’) und Höhe (mm) in Abhängigkeit von der Zeit bei 1 % Alginat, vernetzt mit einer 50 mM CaCl₂-Lösung (*p-<t 0,0001 für 0 gegenüber jeder Stunde).

Abbildung 3. 1 %iges Alginat, vernetzt mit (A) 10 mM und (B) 50 mM CaCl₂-Lösung.

Die Auflösung der mit 10 mM CaCl₂-Lösung vernetzten und in kalziumfreiem PBS inkubierten 1-prozentigen Alginatproben wurde über einen Zeitraum von 24 Stunden untersucht. Die Werte von G’ (Pa) als Funktion der Zeit sind in Abb. 4 dargestellt. Die Auflösung des Alginats durch die Freisetzung von Kalziumionen im PBS war während der ersten 24 Stunden der Inkubation bei 37 °C signifikant, wie der mit der Zeit abnehmende G’-Wert zeigt (20 %ige Abnahme nach 24 Stunden). Die Überwachung der Auflösung war während der ersten 24 Stunden möglich; danach war die Probe kein zusammenhängendes Hydrogel mehr.

Abbildung 4. Durchschnittlicher Scherspeichermodul (G’) als Funktion der Zeit während der Inkubation mit PBS ohne Kalzium von 1 % Alginat, das mit einer 10 mM CaCl₂-Lösung vernetzt wurde (*p-<t 0,0001 für 0 gegenüber jeder Stunde).

Schlussfolgerungen und Ausblick

Die Konzentration der CaCl₂-Lösung führte zu unterschiedlichen Verhaltensweisen während der Vernetzung: Alginat quoll bei der niedrigsten Konzentration an und schrumpfte bei der höchsten Konzentration (p<0,05). Dies stand im Zusammenhang mit der Vernetzungsgeschwindigkeit, die mit steigender Kalziumkonzentration zunahm. Eine höhere Kalziumkonzentration führte zu steiferen Hydrogelen (p<0,05). Bei der Inkubation mit kalziumfreiem PBS wurde eine Auflösung der mit einer 10-mM-Kalziumlösung vernetzten Alginat-Hydrogele beobachtet (p<0,05).

Alginat-Hydrogele von Cellink lassen sich leicht mit CaCl₂ vernetzen, und ihre viskoelastischen Eigenschaften können durch Variieren der Kalziumkonzentration angepasst werden.
Die viskoelastischen Eigenschaften derselben Probe können im ElastoSens™ Bio nach aufeinanderfolgenden Inkubationen mit dem Vernetzungsmittel gemessen werden.
Das Verständnis des Verhaltens von Alginat-Hydrogelen mit verschiedenen Vernetzungslösungen ist von großem Nutzen für die optimale Gestaltung von Experimenten.
ElastoSens™ Bio ist in der Lage, geringfügige Unterschiede in den viskoelastischen Eigenschaften von Alginat-Hydrogelen während der Vernetzung und der Auflösung zu erkennen.

Literaturverzeichnis

[1] Hecht, H., & Srebnik, S. (2016). Structural characterization of sodium alginate and calcium alginate. Biomacromolecules, 17(6), 2160-2167.

[2] Jia, J., Richards, D. J., Pollard, S., Tan, Y., Rodriguez, J., Visconti, R. P., … & Mei, Y. (2014). Engineering alginate as bioink for bioprinting. Acta biomaterialia, 10(10), 4323-4331.

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