应用说明 | ElastoSens™ Bio
海藻酸盐水凝胶交联：利用ElastoSens™ Bio进行粘弹性表征
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本研究是Rheolution（加拿大魁北克省蒙特利尔）与CELLINK（美国马萨诸塞州波士顿）合作开展的。
摘要
- 藻酸盐是一种从海藻中提取的天然生物材料，广泛用于细胞和蛋白质的递送以及组织工程领域。
- 在水溶液中，藻酸盐在多价阳离子（例如 Ca2+）的作用下会迅速交联，从而形成一种力学性能可调的水凝胶。
- 最低浓度的氯化钙溶液会引起膨胀，并导致海藻酸盐凝胶的交联速度变慢。
- 较高浓度的氯化钙溶液能促进快速交联，从而导致藻酸盐凝胶收缩。
- 氯化钙溶液浓度越高，所形成的藻酸盐凝胶就越硬。
- 海藻酸盐水凝胶在不含氯化钙的盐溶液（例如PBS）中孵育后会溶解。
藻酸盐水凝胶的应用与交联机制
引言
藻酸盐是一种多糖，作为海藻的结构成分和土壤细菌的荚膜成分存在。该多糖通常从褐藻中提取，因其具有增稠、凝胶化和稳定等特性，被广泛应用于医疗、制药、食品、纺织等众多行业。 在水溶液中，海藻酸钠可在多价阳离子（如 Ca2+）的作用下迅速交联，从而形成一种力学性能可调的水凝胶。 这一简单且经济高效的工艺，加上其能够保留大量液体的特性，使藻酸盐成为生物技术应用（如药物和细胞递送以及组织工程）中一种有价值的生物材料[1]。
海藻酸盐水凝胶既可注入体内，也可以预成型形状植入体内。对于后一种情况，海藻酸盐通常采用基于挤出的3D打印技术进行加工，这需要快速的凝胶化过程。 该多糖在温和条件下（与多价阳离子混合时）可快速凝胶化，从而能够轻松、快速地将细胞包封起来 [2]。
通过改变聚合物浓度和分子量、交联剂的类型及浓度等不同参数，可以调节藻酸盐的粘弹性特性。 在本应用说明中，将 CELLINK 提供的 1% 藻酸盐与不同浓度（10 mM 和 50 mM）的氯化钙 (CaCl2) 溶液进行交联，并在与该溶液连续孵育后，使用 ElastoSens™ Bio 测量其粘弹性特性。 此外，还评估了一种交联海藻酸钠制剂（10 mM）在盐水（PBS）中孵育 24 小时后的力学稳定性。
用于评估藻酸盐水凝胶交联的实验装置
材料与方法
海藻酸盐 1% 和 CaCl2 溶液（10 mM和 50 mM) 购自 CELLINK（美国波士顿）。将 3 毫升海藻酸钠溶液倒入 ElastoSens™ 中 Bio的样品架和3毫升的 CaCl2溶液 将溶液轻轻加在样品表面，静置15分钟。随后移除溶液，以便在ElastoSens™上测量藻酸盐的粘弹性性能。 在 25 °C 下进行生物测定 5 分钟（时间步长为 10 秒）。在最初的几个小时内，重复了这一最后步骤。对于经 CaCl2 在10 mM浓度下，将溶液置于室温下过夜，移除溶液后约24小时进行最后一次测量。随后向这些样品中加入无钙PBS，以评估其在37 °C条件下随时间推移的溶解情况。 在前6小时内每小时进行一次测量（每次测量持续5分钟，时间间隔为10秒），并在孵育24小时后进行最后一次测量。平均结果以均值 ± 标准差表示。样本数量为3（n = 3）。 统计分析采用GraphPad Prism 9版软件（GraphPad Prism软件公司，美国加利福尼亚州拉霍亚）进行。组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），并结合事后Tukey检验对多重比较进行校正。当p< 0.05时，认为具有统计学意义。
氯化钙浓度对海藻酸盐水凝胶性能的影响
结果与讨论
每种交联条件（10 mM 和 50 mM CaCl₂）各取三个样品，在 ElastoSens™ Bio 设备中进行周期性测试。 图 1 和图 2 显示了使用 10 mM CaCl2 溶液的藻酸盐在每个时间点的剪切储能模量 G’（Pa）和样品高度（mm）的平均值。 对于用 10 mM CaCl2 交联的样品，凝胶在初始时间点发生了膨胀，其平均高度的增加证实了这一点。在孵育 45 分钟至 4 小时后，高度的增加不那么明显（图 3A）。 24 小时后的最终高度表明，样品仍具有显著的膨胀（比初始高度高出 68%）。G’ 在最初 30 分钟内的轻微下降表明，此时的膨胀程度大于已形成的交联程度。 此后，G’值随时间呈现出预期中的平缓上升趋势，在与CaCl₂溶液孵育4小时后达到645 ± 55 Pa（每15分钟的读数均存在统计学差异）。 经24小时孵育后，交联凝胶的最终G’值为887 ± 9 Pa。 Tan(δ) 在孵育 15 分钟至 4 小时期间保持稳定（约 0.15），但在 24 小时后出现上升，达到 0.3（数据未显示）。 这一增加表明，随着时间的推移，水凝胶的粘性部分变得更加占主导地位。
图1.用10 mM CaCl₂溶液交联的1%海藻酸盐的平均剪切储能模量（G’）和高度（mm）随时间变化的曲线（*p<0.0001，0小时与每小时数据相比）。
对于用 50 mM CaCl₂ 交联的试样，观察到了相反的现象：试样随时间推移而收缩。由于这种现象，一旦试样完全脱离了试样架内壁（图 3B）——这是试验的一项要求——试验即告终止。 G’值随时间增加，经1.5小时孵育后达到2832 ± 53 Pa（每5分钟的读数均存在统计学差异）。试样高度随时间下降（因收缩所致），而tan(δ)值保持稳定（约0.15）。
图2.用50 mM CaCl₂溶液交联的1%海藻酸盐的平均剪切储能模量（G’）和高度（mm）随时间的变化情况（*p<0.0001，比较0小时与每小时的数据）。
A
B
图3。 用（A）10 mM和（B）50 mM的CaCl₂溶液交联的1%海藻酸盐。
对用10 mM CaCl₂溶液交联并在无钙PBS中孵育的1%海藻酸钠样品，进行了24小时的溶解性评估。图4给出了G’（Pa）随时间变化的曲线。 如图所示，在37 °C下孵育的前24小时内，PBS中钙离子的释放导致海藻酸盐显著溶解，这体现在G’值随时间下降（24小时后下降20%）。 在最初的24小时内可以监测到这种溶解现象，此后样品不再是具有凝聚性的水凝胶。
图4.含10 mM CaCl₂溶液交联的1%海藻酸盐在不含钙的PBS中孵育期间，平均剪切储能模量（G’）随时间的变化曲线（*p<0.0001，0小时与各小时相比）。
结论与展望
CaCl₂溶液的浓度导致交联过程中表现出不同的行为：在最低和最高浓度下，藻酸盐分别发生膨胀和收缩（p<0.05）。这与交联速度有关，随着钙浓度的增加，交联速度也随之提高。 较高的钙浓度导致水凝胶更坚硬（p<0.05）。在与不含钙的PBS孵育过程中，观察到用10 mM钙溶液交联的海藻酸盐水凝胶发生溶解（p<0.05）。
- Cellink 公司的藻酸盐水凝胶可轻松通过 CaCl₂ 进行交联，其粘弹性性能可通过调节钙浓度来调控。
- 在与交联剂进行连续孵育后，可在ElastoSens™ Bio中测量同一样品的粘弹性特性。
- 了解不同交联溶液对藻酸盐水凝胶行为的影响，对于更好地设计实验具有重要意义。
- ElastoSens™ Bio 能够检测藻酸盐水凝胶在交联和溶解过程中粘弹性性质的细微差异。
参考文献
[1] Hecht, H., & Srebnik, S. (2016). Structural characterization of sodium alginate and calcium alginate. Biomacromolecules, 17(6), 2160-2167.
[2] Jia, J., Richards, D. J., Pollard, S., Tan, Y., Rodriguez, J., Visconti, R. P., … & Mei, Y. (2014). Engineering alginate as bioink for bioprinting. Acta biomaterialia, 10(10), 4323-4331.
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