アプリケーションノート | ElastoSens™ Bio
アルギネートハイドロゲルの架橋：ElastoSens™ Bioを用いた粘弾性特性の評価
協力：
お知らせ
本研究は、Rheolution（カナダ・ケベック州モントリオール）とCELLINK（米国・マサチューセッツ州ボストン）の共同研究によるものである。
概要
- アルギネートは、藻類から得られる天然の生体材料であり、細胞やタンパク質の送達、および組織工学の分野で広く利用されている。
- アルギネートは、水溶液中の多価陽イオン（例：Ca2+）の存在下で急速に架橋反応を起こし、機械的特性を調整可能なハイドロゲルを形成する。
- 塩化カルシウム溶液の濃度が最も低い場合、膨潤が生じ、アルギン酸ゲルの架橋が緩慢になった。
- 塩化カルシウム溶液の濃度が高くなると、架橋反応が速く進行し、その結果、アルギン酸ゲルが収縮した。
- 塩化カルシウム溶液の濃度が高くなるにつれて、アルギン酸ゲルはより硬くなった。
- アルギネートハイドロゲルは、塩化カルシウムを含まない生理食塩水（例：PBS）中でインキュベートすると溶解することがあります。
アルギネートハイドロゲルの応用と架橋メカニズム
はじめに
アルギン酸塩は、藻類の構造成分や土壌細菌の莢膜成分として存在する多糖類である。この多糖類は通常、褐藻から抽出され、その増粘性、ゲル化性、安定化特性から、医療、製薬、食品、繊維などの多くの産業で利用されている。 アルギン酸塩は、水溶液中で多価陽イオン（例：Ca2+）の存在下で迅速に架橋反応を起こし、機械的特性を調整可能なハイドロゲルを形成する。 この簡便かつ費用対効果の高いプロセスと、大量の液体を保持する能力により、アルギン酸は、薬剤や細胞の送達、組織工学などのバイオテクノロジー用途において、貴重な生体材料となっています[1]。
アルギン酸ハイドロゲルは、体内に注入することも、あらかじめ成形した形状で移植することも可能です。後者の場合、アルギン酸は押出式3Dプリンティングを用いて加工されることが多く、そのためには迅速なゲル化プロセスが必要となります。 この多糖類は、穏やかな条件下（多価陽イオンと混合した場合）で迅速にゲル化するため、細胞を容易かつ迅速に封入することが可能となる[2]。
アルギン酸塩の粘弾性特性は、ポリマー濃度や分子量、架橋剤の種類や濃度といったさまざまなパラメータを変更することで調整することができます。 このアプリケーションノートでは、CELLINK社の1%アルギン酸を、異なる濃度（10 mMおよび50 mM）の塩化カルシウム（CaCl2）溶液で架橋し、その溶液で順次インキュベートした後、ElastoSens™ Bioを用いてその粘弾性特性を測定しました。 さらに、1 種類の架橋アルギン酸塩製剤（10 mM）について、生理食塩水（PBS）中で 24 時間にわたりインキュベートし、その機械的安定性を評価しました。
アルギン酸ハイドロゲルの架橋を評価するための実験装置
材料および方法
アルギネート 1％およびCaCl2 溶液（10 mMおよび 50 mM)はCELLINK社（米国ボストン）から入手した。3 mLのアルギン酸をElastoSens™に注ぎ込んだ Bio社のサンプルホルダーと3 mLの CaCl2 溶液を試料の上から静かに滴下し、15分間放置した。その後、溶液を取り除き、ElastoSens™を用いてアルギン酸の粘弾性特性を測定した。 25 °Cで5分間バイオ処理を行った（10秒ごとの時間ステップで）。この最後の手順を、最初の数時間にわたって繰り返した。以下の方法で架橋処理された試料については、 CaCl2 10 mMの濃度で、溶液を室温で一晩放置し、溶液を取り除いてから約24時間後に最終測定を行った。その後、これらの試料にカルシウムを含まないPBSを添加し、37 °Cにおける経時的な溶解度を評価した。 測定は最初の6時間の間、1時間ごとに（5分間、10秒間隔で）行い、24時間のインキュベーション後に最終測定を行った。平均結果は平均値±標準偏差として表した。試料数は3つ（n = 3）であった。 統計解析は、GraphPad Prism バージョン9（GraphPad Prismソフトウェア、米国カリフォルニア州ラホヤ）を用いて行った。群間の比較については、一元配置分散分析（ANOVA）を行い、多重比較の補正として事後検定としてTukey検定を用いた。p値が< 0.05の場合を有意とみなした。
塩化カルシウム濃度によるアルギン酸ハイドロゲルの物性への影響
結果と考察
各架橋条件（10 mMおよび50 mM CaCl2）について、それぞれ3つの試料をElastoSens™ Bioで定期的に試験した。 10 mM CaCl2 溶液を用いたアルギン酸塩の、各時点におけるせん断貯蔵弾性率 G’ (Pa) および試料の高さ (mm) の平均値を、図 1 および 2 に示します。 10 mM CaCl2 で架橋された試料については、初期の時点においてゲルが膨潤し、そのことは平均高さの増加によって確認されました。45 分から 4 時間のインキュベーション後、高さの増加はそれほど顕著ではなくなりました（図 3A）。 24時間後の最終的な高さからは、試料が依然として著しい膨潤を示していることがわかった（初期の高さより68％高い）。最初の30分間にG’がわずかに減少したことは、その時点までに形成された架橋よりも膨潤の方が顕著であったことを示唆している。 その後、G’は時間の経過とともに緩やかかつ予想通りの増加を示し、CaCl₂溶液との4時間のインキュベーション後に645 ± 55 Paに達した（15分ごとに統計的な有意差が認められた）。 24時間のインキュベーション後の架橋ゲルの最終的なG’は887 ± 9 Paであった。 Tan(δ) は、インキュベーション開始から 15 分から 4 時間までは安定していた（約 0.15）が、24 時間後には 0.3 まで上昇した（データ未掲載）。 この増加は、時間の経過とともにハイドロゲルの粘性部分がより顕著になったことを示唆している。
図1.10 mM CaCl₂溶液で架橋された1%アルギン酸塩の、時間の経過に伴う平均せん断貯蔵弾性率（G’）および高さ（mm）の推移（*p<0.0001：0時間対各時間）。
50 mM CaCl₂で架橋された試料については、逆の挙動が観察された。すなわち、試料は時間の経過とともに収縮した。この挙動のため、試験の要件である試料ホルダーの内壁との接触が完全に失われた時点で試験を中止した（図3B）。 G’は時間の経過とともに増加し、1.5時間のインキュベーション後に2832 ± 53 Paのレベルに達した（5分ごとの測定値で統計的な有意差が認められた）。高さは時間の経過とともに減少した（収縮によるもの）が、tan(δ)は安定していた（約0.15）。
図2.50 mM CaCl₂溶液で架橋された1%アルギン酸塩の、時間の関数としての平均せん断貯蔵弾性率（G’）および高さ（mm）（*p<0.0001：0時間対各時間）。
A
B
図3。 (A) 10 mM および (B) 50 mM の CaCl₂ 溶液で架橋された 1% アルギネート。
10 mM CaCl₂溶液で架橋され、カルシウムを含まないPBS中でインキュベートされた1%アルギネート試料の溶解を、24時間にわたって評価した。時間の関数としてのG’（Pa）の値を図4に示す。 37 °Cでのインキュベーション開始後24時間の間、PBS中のカルシウムイオンの放出によるアルギネートの溶解が顕著であり、これは時間の経過に伴うG’の減少（24時間後に20%の減少）からも明らかである。 溶解のモニタリングは最初の24時間の間は可能であったが、それ以降は試料はもはや凝集性ハイドロゲルではなくなっていた。
図4. 10 mM CaCl₂溶液で架橋された1%アルギン酸塩を、カルシウムを含まないPBS中でインキュベートした際の、時間の経過に伴う平均せん断貯蔵弾性率（G’）（*p<0.0001：0時間対各時間）。
結論と展望
CaCl₂溶液の濃度によって、架橋過程における挙動に違いが見られた。アルギン酸塩は、最低濃度では膨潤し、最高濃度では収縮した（p<0.05）。これは架橋速度に関係しており、カルシウム濃度が上昇するにつれて架橋速度は高くなった。 カルシウム濃度が高いほど、ハイドロゲルの剛性が高くなった（p<0.05）。10 mMのカルシウム溶液で架橋されたアルギン酸ハイドロゲルは、カルシウムを含まないPBS中でインキュベーション中に溶解が観察された（p<0.05）。
- Cellink社のアルギネートハイドロゲルは、CaCl₂を用いて容易に架橋することができ、カルシウム濃度を変えることでその粘弾性特性を調整することができます。
- 同一試料の粘弾性特性は、架橋剤による連続的なインキュベーションの後、ElastoSens™ Bioを用いて測定することができます。
- さまざまな架橋溶液を用いたアルギン酸ハイドロゲルの挙動を理解することは、実験をより適切に設計する上で有益である。
- ElastoSens™ Bioは、架橋および溶解の過程において、アルギン酸ヒドロゲルの粘弾性特性のわずかな変化を検出することができます。
参考文献
[1] Hecht, H., & Srebnik, S. (2016). Structural characterization of sodium alginate and calcium alginate. Biomacromolecules, 17(6), 2160-2167.
[2] Jia, J., Richards, D. J., Pollard, S., Tan, Y., Rodriguez, J., Visconti, R. P., … & Mei, Y. (2014). Engineering alginate as bioink for bioprinting. Acta biomaterialia, 10(10), 4323-4331.
当社の技術が、微小な量の試料を用いて、軟らかい生体材料や組織の粘弾性特性を非破壊的に測定する仕組みをご覧ください。
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