Rheolutionの記事
4Dバイオプリンティングとは何か、そしてなぜそれが生物医学において重要なのか
by Dr. Antoine Frayssinet
Rheolution Inc. 上級アプリケーションスペシャリスト
4Dバイオプリンティングは、3Dプリンティングと何が違うのでしょうか？
人体への移植を目的とした、細胞を播種した3Dプリント造形物は、特定の変性や疾患を局所的に緩和するように設計されています。しかし、これらのインプラントは静的で無生物であるのに対し、生体組織の環境は動的であり、組織は時間の経過とともに変動する生物物理的、生化学的、および機械的刺激にさらされています。 4Dバイオプリンティングにより、科学界は最近、「時間」を第4の次元として取り入れました。これにより、スキャフォールドやハイドロゲルは、印刷後に生物学的要因または外部刺激の作用によって、時間の経過とともに変化する能力を持つようになりました。
刺激は、4次元生体材料の形状変化をどのように引き起こすのか？
まず、ハイドロゲルに磁場や温度変化（例えば、ポリ（N-イソプロピル-ラクリルアミド（PNIPAAm）やポリ（ε-カプロラクトン） （PCL）など）、光照射、あるいは湿度（例えば、二層構造のポリエチレングリコール（PEG）など）によって誘起される。 先週の「今月の記事」で取り上げた4D バイオプリンティングに関する記事では、光に反応し、印刷後に光照射を受けることで複雑な形状に折りたたまれるアルギン酸塩ベースのハイドロゲルの具体的な例が紹介されました。 設計された形状の複雑さは非常に印象的で、例えば、ルイス博士のチームは、アクリルアミドと混合したセルロースフィブリルを用いて、生体適合性のある複合インクでランの花のデザインを再現しました（下図）[3]。このように、押し出されたバルクハイドロゲルは、プリント後に形状を変えることができます。 ただし、印刷後の望ましい効果は場合によって異なる。
4Dバイオプリンティングは、どのようにして制御された薬物送達を実現できるのでしょうか？
インクジェットバイオプリンティングなどのマルチスケールアプローチを用いることで、印刷プロセス中に形状を設計することができ、その後、カプセル化された薬剤の放出を誘発することが可能です。例えば、細胞膜を人工的に模倣した二重層脂質マイクロスフィアであるリポソームを、2種類の異なる塩濃度を含む状態で印刷しました。 この誘導された浸透圧勾配を利用することで、著者らは、温度やpHの変化に応じて、各プリントされた微小球の内部に封入された成分を放出できる3Dマクロ球を形成することに成功した[4]。
マイクロスイマーとは何ですか？また、どのように機能するのでしょうか？
ETHチューリッヒの別の研究グループは、細胞毒性のない光重合性メタクリル化ゼラチン（GelMA）を用いたナノハイドロゲルを開発した。 標的指向性薬物送達のために特別に開発されたこれらのナノハイドロゲル（「マイクロスウィマー」とも呼ばれる）は、表面に磁性ナノ粒子を付着させることで、磁気に反応する性質を持たせられた[5]。 体液中での遊泳性能を最適化するためにらせん状にプリントされたこれらのマイクロスウィマーは、磁場によって標的組織へと誘導できる安定した薬剤担体です。 所定の位置に到達すると、搭載されていた薬剤を放出し、その後、コラーゲナーゼ（コラーゲンやゼラチンを分解する酵素）によって迅速に（5～15分）分解され、細胞毒性のない分解残渣となる。この場合、第4の次元とは、短期間におけるゲルの酵素による分解を指す。
生物学的トリガーは、4D生体材料にどのような影響を与えるのでしょうか？
実際、グルコース濃度や特定の酵素といった生体シグナルは、プリントされたハイドロゲルに影響を与える可能性があります。 2018年に報告された、米国ノースカロライナ大学と中国蘇州大学の共同研究では、腫瘍微小環境内で生物学的に生成される活性酸素種（ROS）に反応するポリ（ビニルアルコール）（PVA）ベースの生体材料が紹介された。 この人工的な生分解により、PVA ベースのハイドロゲルは、3 週間後に分解される前に抗腫瘍薬を局所的に送達することで、生体内の抗腫瘍反応を高め、腫瘍の再発を防ぐことができました [6]。 同様の原理に基づき、コラーゲン、ゼラチン、ケラチンなどのpH感受性生体材料は、pH値が低下する炎症部位の近くで有用である可能性がある。
細胞は、ハイドロゲルの4次元的な成熟をどのように促進しているのか？
再生型ハイドロゲルの機能性は、スキャフォールド自体の成熟に伴い段階的に開発することも可能です。そこでは、播種された細胞が環境に応答して「マイクロファクトリー」として機能し、標的となる変性組織に適応した独自のマトリックスや表現型プロファイルを生成します（上の図を参照）。 この微小生産の性質は、成長因子、分化因子（播種された幹細胞の場合）、あるいは例えばインプラントの機械的特性などを用いて調整することが可能です[7]。臨床用生体材料を開発する際にこの細胞活動を考慮することは、生体材料のプリント後の刺激そのものと矛盾するものではありません。 折り紙の手法に従い、栗林重富らは、線維芽細胞（紡錘形の一般的な細胞）の細胞牽引力を利用して、立方体、球体、中空管などの複雑な3D微細構造を生成することに成功した。 この場合、細胞は部分的にフィブロネクチンで被覆されたガラスマイクロプレート上に播種された。これらの細胞が時間の経過とともに周囲の環境を引っ張る能力を利用して「第4の次元」が導入され、3Dスキャフォールドの設計に活用された[8]。
実用例：ステントやスマート創傷被覆材
近年、4Dバイオプリントされた生体材料を用いて、ステント（例えば動脈や静脈内に配置され、その構造を補強する中空の構造体）の開発に関する研究が進められている。臨床医は、巻き上げられた状態のステントを人体組織内に容易に挿入し、その後、特定の刺激を与えることでステントを展開させ、人体の血管を効率的に支えることができる。 メタクリル化PEG系生体材料、アルギン酸塩、あるいはヒアルロン酸を用いて、成功した設計例が生み出された[9][10]。 この短い総説の締めくくりとして、もう1つの応用例を紹介すると、カナダのアクバリ博士のチームによってスマート創傷被覆材も開発された。この被覆材は、pH値をモニタリングすることで細菌感染を検出する（測定されたpH値に応じて、外側に特定の色で表示される視覚的マーカーを備えている）。 感染が検出されると、プリントされたハイドロゲルが創傷部位で抗生物質を放出し、感染に対抗する[11]。
ライフサイエンス分野における4Dバイオプリンティングの今後の展望は？
4Dバイオプリンティングは、多くの応用分野を持つ、生物医学分野において非常に有望な技術です。しかし、生体組織をより忠実に再現するために細胞の配列を制御することなど、依然として課題が残されています。このような微細な異方性を持つ細胞配列の例は、当誌で発表した研究において報告されています。 今月の記事 3月に発表された。もう1つの大きな課題は、機械的特性、細胞の構成や表現型、細胞外マトリックスの性質や複雑性といった観点から、対象となる変性組織に適した特性を備えたバイオインクを開発することである。全体として、前回の論文で紹介したさまざまな3Dバイオプリンティングプロセスを用いて Rheolutionの記事 4月現在、4Dバイオプリンティングは「概念実証」研究から臨床応用へと、順調に進展している。
参考文献
[1] Gao, B., Yang, Q., Zhao, X., Jin, G., Ma, Y., Xu, F., (2016). 4D Bioprinting for Biomedical Applications. Trends Biotechnology, Special Issue: Biofabrication, 34, 746–756.
[2] Yang, Q., Gao, B., Xu, F., (2020). Recent Advances in 4D Bioprinting. Biotechnology Journal, 15, 1900086.
[3] Sydney Gladman, A., Matsumoto, E.A., Nuzzo, R.G., Mahadevan, L., Lewis, J.A., (2016). Biomimetic 4D printing. Nature Materials, 15, 413–418.
[4] Villar, G., Graham, A.D., Bayley, H., (2013). A Tissue-Like Printed Material. Science, 340, 48–52.
[5] Wang, X., Qin, X.-H., Hu, C., Terzopoulou, A., Chen, X.-Z., Huang, T.-Y., Maniura-Weber, K., Pané, S., Nelson, B.J., (2018). 3D Printed Enzymatically Biodegradable Soft Helical Microswimmers. Advanced Functional Materials, 28, 1804107.
[6] Wang, C., Wang, J., Zhang, X., Yu, S., Wen, D., Hu, Q., Ye, Y., Bomba, H., Hu, X., Liu, Z., Dotti, G., Gu, Z., (2018). In situ formed reactive oxygen species-responsive scaffold with gemcitabine and checkpoint inhibitor for combination therapy. Science Translational Medicine, 10(429), eaan3682.
[7] Engler, A.J., Sen, S., Sweeney, H.L., Discher, D.E., (2006). Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell, 126, 677–689.
[8] Kuribayashi-Shigetomi, K., Onoe, H., Takeuchi, S., (2012). Cell Origami: Self-Folding of Three-Dimensional Cell-Laden Microstructures Driven by Cell Traction Force. PLOS ONE, 7, e51085.
[9] Ge, Q., Sakhaei, A.H., Lee, H., Dunn, C.K., Fang, N.X., Dunn, M.L., (2016). Multimaterial 4D Printing with Tailorable Shape Memory Polymers. Scientific Reports, 6, 31110.
[10] Kirillova, A., Maxson, R., Stoychev, G., Gomillion, C.T., Ionov, L., (2017). 4D Biofabrication Using Shape-Morphing Hydrogels. Advanced Materials, 29(46).
[11] Mirani, B., Pagan, E., Currie, B., Siddiqui, M.A., Hosseinzadeh, R., Mostafalu, P., Zhang, Y.S., Ghahary, A., Akbari, M., (2017). An Advanced Multifunctional Hydrogel-Based Dressing for Wound Monitoring and Drug Delivery. Advanced Healthcare Materials, 6(19).
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