4D生物打印与3D打印有何不同？
旨在植入人体的3D打印细胞种子化物体，其设计初衷是针对性地缓解特定的退行性病变或疾病。然而，与原生组织所处的动态环境相比，这些植入物是静态且无生命的——在原生组织环境中，组织会随着时间推移而受到波动的生物物理、生化及机械刺激。 借助4D生物打印技术，科学界最近将“时间”作为第四维度纳入其中：支架和水凝胶在打印后具有随时间演变的能力，这种演变既可由生物过程驱动，也可通过施加外部刺激实现。
刺激是如何引发4D生物材料形状变化的？
首先，通过对水凝胶施加物理刺激（例如磁场、温度变化——如使用聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PNIPAAm）或聚（ε-己内酯） (PCL)）、光照或湿度（例如双层聚乙二醇(PEG)）等物理刺激，从而诱导水凝胶发生打印后的形状变化。 上周发布的“本月最佳文章”——关于 4D 生物打印的文章，提供了一个具体的例子：一种基于藻酸盐的水凝胶，它对光敏感，并能够根据打印后光照的诱导折叠成复杂的形状。 设计形状的复杂程度相当惊人，例如，刘易斯博士的团队将纤维素细丝与丙烯酰胺混合，使用生物相容性复合墨水再现了兰花的花朵设计（下图）[3]。因此，这些挤出的体积型水凝胶在打印后可以改变形状。 不过，打印后期望达到的效果可能各不相同。
4D生物打印如何实现可控药物递送？
该形状可在打印过程中通过多尺度方法（例如喷墨生物打印）进行设计，随后可触发包封药物的释放。例如，打印出的脂质体（一种模拟细胞膜的双层脂质微球）内含两种不同浓度的盐溶液。 通过利用这种诱导的渗透压梯度，作者成功制备出三维大微球，这些大微球在温度或pH值发生变化时，能够释放每个打印微球内部装载的成分[4]。
什么是微型游泳机器人？它们是如何工作的？
苏黎世联邦理工学院（ETH Zürich）的另一研究团队开发了一种基于无细胞毒性、光交联型甲基丙烯酸酯化明胶（GelMA）的纳米水凝胶。 这些纳米水凝胶（也被称为“微游动体”）专为靶向药物输送而开发，通过在表面修饰磁性纳米颗粒，使其具有磁响应性 [5]。 为了优化其在体液中的游动性能，这些微型游动体被打印成螺旋形状，是一种稳定的药物载体，可通过磁场引导至目标组织。 一旦到达目标位置，它们即可释放所载药物，随后在5-15分钟内被胶原酶（一种能分解胶原蛋白和明胶的酶）迅速降解，且降解后的残留物对细胞无毒性。在此情况下，“第四维度”表现为凝胶在短时间内发生的酶促降解。
生物诱因如何影响4D生物材料？
事实上，葡萄糖浓度或特定酶等生物信号可能会对打印的水凝胶产生影响。 美国北卡罗来纳大学与中国苏州大学于2018年联合发表的一项研究报道了一种基于聚乙烯醇（PVA）的生物材料，该材料对肿瘤微环境中生物合成的活性氧（ROS）敏感。 通过这种工程化的生物降解，基于 PVA 的水凝胶能够在 3 周后降解之前，通过局部输送抗肿瘤药物来增强体内抗肿瘤反应并预防肿瘤复发 [6]。 遵循同样的原理，胶原蛋白、明胶和角蛋白等pH敏感型生物材料可在pH值下降的炎症部位发挥作用。
细胞如何驱动水凝胶的4D成熟？
再生水凝胶的功能也可随着支架本身的成熟而逐步发展，其中，植入的细胞会根据环境变化作出反应，像微型工厂一样运作，产生适合目标退化组织的自身基质和表型特征（见上图）。 这种微生产过程的性质可通过生长因子、分化因子（若为接种干细胞）或例如植入物的力学性能进行调控[7]。在开发用于临床的生物材料时，将这种细胞活性纳入考量，并不与生物材料打印后的刺激作用相矛盾。 利用折纸技术，Kuribayashi-Shigetomi等人成功利用成纤维细胞（纺锤形普通细胞）的细胞牵引力，生成立方体、球体或中空管等复杂的3D微结构。 在此研究中，细胞被接种在部分覆盖有纤维连接蛋白的玻璃微板上。通过利用这些细胞随时间推移对周围环境施加牵引力的能力，引入了“第四维度”，并据此设计出三维支架[8]。
实际应用：支架和智能伤口敷料
近年来，研究人员利用4D生物打印技术制备生物材料，用于开发支架——即置入动脉或静脉等部位以强化其结构的中空网状结构。临床医生可轻松将卷曲的支架植入人体组织内，随后通过特定刺激将其展开，从而有效支撑人体血管。 研究人员已成功利用甲基丙烯酰化聚乙二醇（PEG）基生物材料、海藻酸盐或透明质酸制备出相关设计[9][10]。 作为本篇简短综述的结尾，再介绍一项应用：加拿大Akbari博士团队还开发了一种智能伤口敷料：该敷料通过监测pH值来检测细菌感染（外部会显示特定颜色，这些视觉标记取决于测得的pH值）。 一旦检测到感染，打印的水凝胶便会在伤口处释放抗生素以对抗感染 [11]。
4D生物打印在生命科学领域的未来发展趋势是什么？
4D生物打印技术应用广泛，是生物医学领域一项极具前景的技术。但目前仍面临一些挑战，例如如何控制细胞取向，以更逼真地模拟天然组织。在我们介绍的研究中，就报告了一个关于微尺度的各向异性细胞取向的实例，该研究 本月精选文章 发表于3月。另一个重大挑战是开发出在力学性能、细胞群和表型、细胞外基质的性质和复杂性等方面均适合目标退化组织的生物墨水。总体而言，利用我们上一期文章中介绍的各种3D生物打印工艺 Rheolution 文章 今年4月，4D生物打印技术正从“概念验证”研究稳步迈向临床应用，前景可期。
参考文献
[1] Gao, B., Yang, Q., Zhao, X., Jin, G., Ma, Y., Xu, F., (2016). 4D Bioprinting for Biomedical Applications. Trends Biotechnology, Special Issue: Biofabrication, 34, 746–756.
[2] Yang, Q., Gao, B., Xu, F., (2020). Recent Advances in 4D Bioprinting. Biotechnology Journal, 15, 1900086.
[3] Sydney Gladman, A., Matsumoto, E.A., Nuzzo, R.G., Mahadevan, L., Lewis, J.A., (2016). Biomimetic 4D printing. Nature Materials, 15, 413–418.
[4] Villar, G., Graham, A.D., Bayley, H., (2013). A Tissue-Like Printed Material. Science, 340, 48–52.
[5] Wang, X., Qin, X.-H., Hu, C., Terzopoulou, A., Chen, X.-Z., Huang, T.-Y., Maniura-Weber, K., Pané, S., Nelson, B.J., (2018). 3D Printed Enzymatically Biodegradable Soft Helical Microswimmers. Advanced Functional Materials, 28, 1804107.
[6] Wang, C., Wang, J., Zhang, X., Yu, S., Wen, D., Hu, Q., Ye, Y., Bomba, H., Hu, X., Liu, Z., Dotti, G., Gu, Z., (2018). In situ formed reactive oxygen species-responsive scaffold with gemcitabine and checkpoint inhibitor for combination therapy. Science Translational Medicine, 10(429), eaan3682.
[7] Engler, A.J., Sen, S., Sweeney, H.L., Discher, D.E., (2006). Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell, 126, 677–689.
[8] Kuribayashi-Shigetomi, K., Onoe, H., Takeuchi, S., (2012). Cell Origami: Self-Folding of Three-Dimensional Cell-Laden Microstructures Driven by Cell Traction Force. PLOS ONE, 7, e51085.
[9] Ge, Q., Sakhaei, A.H., Lee, H., Dunn, C.K., Fang, N.X., Dunn, M.L., (2016). Multimaterial 4D Printing with Tailorable Shape Memory Polymers. Scientific Reports, 6, 31110.
[10] Kirillova, A., Maxson, R., Stoychev, G., Gomillion, C.T., Ionov, L., (2017). 4D Biofabrication Using Shape-Morphing Hydrogels. Advanced Materials, 29(46).
[11] Mirani, B., Pagan, E., Currie, B., Siddiqui, M.A., Hosseinzadeh, R., Mostafalu, P., Zhang, Y.S., Ghahary, A., Akbari, M., (2017). An Advanced Multifunctional Hydrogel-Based Dressing for Wound Monitoring and Drug Delivery. Advanced Healthcare Materials, 6(19).
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